PI3K/Akt通路在槲皮素后處理減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用

王赟，張宗澤，張婧婧，陳瑩瑩，吳云，王焱林

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢430071)

磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的凋亡、存活以及增殖等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[1]。槲皮素是一種廣泛存在于植物和紅酒中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗病毒和保護(hù)心肌等多種功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制腦缺血/再灌注損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡[3]。無論在缺血前還是在再灌注初期，給予適量的槲皮素均可減小再灌注引發(fā)的心肌梗死面積，減輕心肌細(xì)胞損傷[4,5]。然而，PI3K/Akt信號(hào)路在槲皮素后處理心肌保護(hù)中的作用目前尚不清楚。2018年5～12月，本研究旨在利用體外心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，模擬心肌缺血/再灌注損傷，觀察槲皮素后處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其與PI3K/Akt通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 新出生1～3 d的SD乳鼠(武漢大學(xué)動(dòng)物中心提供)。槲皮素、MTT、Wortmannin和溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma公司，美國)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz，美國)。Annexin-V/PI凋亡試劑盒(Becton公司，美國)；LDH試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]的方法，無菌條件下分離乳鼠心室肌，剪成1 mm3碎塊，加入0.125%胰酶消化碎塊。將消化完全的細(xì)胞懸液加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，采用差速貼壁分離法純化心肌細(xì)胞。同時(shí)加入0.1 mmol/L 5-溴脫氧核苷以抑制非心肌細(xì)胞的增殖。收集懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度后接種于6孔板中，每孔置于37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 H/R模型制備 參照文獻(xiàn)[7]并加以改進(jìn)。心肌細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，棄去含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入預(yù)先用95%N2+5%CO2飽和過的無血清無糖的DMEM培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于通有95%N2+5%CO2厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h模擬缺氧。2 h后將無糖培養(yǎng)基換成含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞放回37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h模擬復(fù)氧。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con組)、H/R組、H/R+槲皮素組(H/R+Que組)、H/R+槲皮素+抑制劑組(H/R+Que+W組)共4組。Con組細(xì)胞正常培養(yǎng)6 h；H/R組僅構(gòu)建H/R模型；H/R+Que組于缺氧結(jié)束時(shí)，在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入終濃度為40 μmol/L的槲皮素，隨即復(fù)氧4 h；H/R+Que+W組于缺氧結(jié)束時(shí)，在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入PI3K抑制劑Wortamannin 100 nmol/L和槲皮素40 μmol/L，余后處理同H/R組。

1.5 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT法。復(fù)氧4 h后，向培養(yǎng)在96孔板中的各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，倒掉培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm波長處測每孔的吸光度。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100。

1.6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性測定 復(fù)氧4 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，按照LDH試劑盒用RT-6000生化自動(dòng)分析儀測定LDH活性。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀。用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，2×105細(xì)胞2 000 r/min離心5 min，用PBS漂洗2次。用500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入FITC標(biāo)記的Annexin V(40 μg/mL)和PI(50 μg/mL)各5 μL，避光反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀檢測。以早期凋亡細(xì)胞(LR)+晚期凋亡細(xì)胞(UR)所占比例表示細(xì)胞凋亡率(%)。

1.8 p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，4 ℃ PBS洗滌2次。加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液，冰上裂解15 min，裂解產(chǎn)物4 ℃、10 000 g離心30 min。上清液用BCA法測定蛋白濃度。等量樣品以12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，將膜用TBST(0.05%Tween-TBS)配制的5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后，分別與一抗室溫反應(yīng)2 h，TBST清洗3次，每次15 min，再與過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h，TBST清洗3次，每次10 min。加入ECL顯色液，曝光顯影。采用AlphaEaseFC4.0軟件(AlphaInnotech公司，美國)進(jìn)行分析。相對(duì)蛋白含量=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 H/R組細(xì)胞存活率低于Con組，H/R+Que組細(xì)胞存活率高于H/R組，H/R+Que+W組細(xì)胞存活率低于H/R+Que組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性比較 H/R組LDH高于Con組，H/R+Que組LDH低于H/R組，H/R+Que+W組LDH活性高于H/R+Que組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞存活率及LDH活性比較

注：與Con比較，*P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05；與H/R+Que組比較，▲P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡比較 與Con組相比，H/R組細(xì)胞凋亡增多(P<0.05)；與H/R組相比,H/R+Que組細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)；與H/R+Que組相比，H/R+Que+W組細(xì)胞凋亡增多(P<0.05)。見表2。

2.4 p-Akt蛋白活性及凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)比較 H/R及H/R+Que組p-Akt蛋白表達(dá)高于其他各組；而H/R+Que+W組p-Akt蛋白水平低于H/R+Que和H/R組。與H/R組比較，H/R+Que組Bcl-2表達(dá)增高、Bax表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比例增高(P均<0.05)。與H/R+Que組比較，H/R+Que+W組Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)增高，Bcl-2/Bax比例降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡率及p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

注：與Con比較，*P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05；與H/R+Que組比較，▲P<0.05。

3 討論

從體外細(xì)胞水平研究藥物對(duì)心肌的保護(hù)作用可以排除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥砩窠?jīng)體液因素的影響，便于更好地闡明藥物對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制。通過減少心肌細(xì)胞氧供，并在一定的時(shí)間范圍內(nèi)恢復(fù)細(xì)胞的氧供，是模擬臨床缺血性心臟病再灌注治療常用的實(shí)驗(yàn)方法[6]。目前建立H/R的方法主要有物理性和化學(xué)性兩種，尤其以物理性混合氣體模型多見[6]。本實(shí)驗(yàn)參照已有的心肌細(xì)胞H/R模型[6]，選擇了不同時(shí)間的單純性物理損傷方法構(gòu)建細(xì)胞H/R模型，并結(jié)合MTT、LDH檢測結(jié)果，最終選擇了缺氧2 h復(fù)氧4 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞培養(yǎng)基LDH漏出量增高，表明細(xì)胞H/R模型構(gòu)建成功。

本研究參照文獻(xiàn)[7]選擇槲皮素的給藥濃度，結(jié)果顯示，與H/R組比較，H/R+Que組心肌細(xì)胞存活率增高、LDH活性降低、細(xì)胞凋亡減少，提示槲皮素后處理可抑制H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用的一類蛋白，細(xì)胞凋亡程度與Bcl-2/Bax比值有關(guān)，Bcl-2/Bax比值增高促進(jìn)細(xì)胞存活，Bcl-2/Bax比值降低促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。本研究結(jié)果顯示，與H/R組比，H/R+Que組Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值增高，表明槲皮素后處理可減輕H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過磷酸化下游的許多功能蛋白、凋亡相關(guān)等效應(yīng)因子而參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化及存活等[1]。大量研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活對(duì)心肌缺血/再灌注損傷發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。缺血后處理可直接激活PI3K/Akt信號(hào)途徑發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。同時(shí)，藥物后處理的心肌保護(hù)機(jī)制的研究也表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可有效減輕心肌損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡[9]。

槲皮素是一種廣泛存在于植物和紅酒中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗病毒和保護(hù)心肌等多種功效[2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素的攝入量與冠心病的發(fā)生呈明顯負(fù)相關(guān)。無論在缺血前還是在再灌注初期給予適量的槲皮素,均可減小再灌注引發(fā)的心肌梗死面積，減輕心肌細(xì)胞損傷[4,5]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，槲皮素可通過減少氧自由基產(chǎn)生、抑制中性粒細(xì)胞浸潤等途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與H/R組比較，H/R+Que組細(xì)胞內(nèi)p-Akt活性增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào)；預(yù)先加入PI3K/Akt特異性抑制劑后，槲皮素后處理的保護(hù)作用明顯受到抑制。提示槲皮素后處理可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)一步干預(yù)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕細(xì)胞損傷。

綜上所述，槲皮素后處理對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。