腹腔注射帕立骨化醇的糖尿病腎病大鼠腎臟病理變化及自噬相關蛋白表達觀察

劉瑩，賈俊亞，林珊

(天津醫科大學總醫院，天津300052)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發癥，是糖尿病患者最常見的死亡原因之一，其臨床特點是持續性蛋白尿和腎功能進行性下降，最終不可避免地發展到終末期腎病(ESRD)[1]。Klotho蛋白是一種單次跨膜蛋白，在腎臟和腦高表達，腎臟低表達Klotho蛋白會促進腎臟纖維化，在DN腎小管上皮細胞上皮間充質轉化(EMT)中起重要作用。Klotho蛋白還是自噬信號的重要調節者。微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬體膜上的標記蛋白，胞漿中存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。LC3蛋白在合成后C端就被相關蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ并保留在自噬體膜上，直到與溶酶體融合，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可以反映自噬水平的高低[2]。帕立骨化醇是具有生物活性的維生素D類似物，除了對慢性腎臟病患者繼發性甲狀旁腺功能亢進具有良好的療效外，還具有腎臟保護作用。有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加腎小管上皮細胞Klotho表達。Tan等[4]研究發現，帕立骨化醇能維持梗阻性腎病小鼠的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、維生素D受體水平，抑制纖連蛋白及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ型mRNA的表達，抑制TGF-β1表達及細胞增殖、凋亡，抑制EMT，減輕腎間質纖維化，保護腎小管上皮細胞完整性。2016年1月6日～2016年4月20日，本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導制備DN大鼠模型，在此基礎上給予帕立骨化醇腹腔注射治療，觀察大鼠腎臟病理變化及自噬相關蛋白(Klotho蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)表達情況，判斷帕立骨化醇對DN大鼠腎損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑及儀器 清潔級雄性SD大鼠18只，體質量約220 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養于天津醫科大學實驗動物中心。帕立骨化醇注射液購于意大利Abbott S.P.A公司，STZ購自美國Sigma-Aldrich生物技術公司，兔抗LC3單抗購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗Klotho多抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗E-cadherin多抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。血糖儀、血糖試紙購自上海羅氏診斷產品有限公司。

1.2 大鼠分組、DN模型制備、帕立骨化醇腹腔注射方法及標本留取 18只雄性SD大鼠隨機分為對照組(A組)、DN組(B組)、DN+帕立骨化醇組(C組)，每組6只。參照文獻[5]方法，B、C組大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg的方法制作DN模型，72 h后測空腹血糖(FPG)，FPG>16.7 mmoL/L認定DN模型制備成功。DN模型制備成功后，C組大鼠每周3次腹腔注射低劑量帕立骨化醇0.4 μg/kg，A、B組同期腹腔注射等量生理鹽水。各組大鼠腹腔注射12周后，取內眥靜脈血，放入代謝籠中禁食水并收集24 h尿液，然后處死大鼠，取大鼠腎臟組織分離腎皮質備檢。

1.3 各組大鼠體質量、血肌酐(Scr)、FPG、尿蛋白測算 第12周末稱量各組大鼠體質量；取內眥靜脈血，采用苦味酸法檢測大鼠Scr，采用快速血糖儀檢測FPG；取收集的24 h尿液，采用比濁法測定尿蛋白。

1.4 各組大鼠腎組織病理形態學檢查 采用六胺銀(PASM)染色法。取大鼠腎臟組織分離腎皮質，固定、石蠟包埋、切片，PASM染色后，顯微鏡下觀察。

1.5 各組大鼠腎小管間質E-cadherin檢測 采用免疫組織化學法。取各組4 μm石蠟切片常規脫蠟至水，3% H2O2阻斷，1% Triton X-100處理5 min，2% BSA封閉30 min，微波修復；滴加適當濃度稀釋的一抗4 ℃過夜，加入HRP標記相應二抗37 ℃ 20 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍攝照片保存，每張切片隨機選取照片10副，采用Image ProPlus 6.0軟件測量照片中陽性反應部位的累計光密度值(IOD)，以IOD值表示大鼠腎小管間質E-cadherin的表達相對表達量。

1.6 各組大鼠腎組織自噬相關蛋白檢測

1.6.1 各組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白檢測 采用免疫熒光法。取各組4 μm石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復，然后漂洗；2% BSA 37 ℃濕盒內封閉30 min，分別加1∶100稀釋的Klotho 4 ℃孵育過夜；漂洗后加熒光標記的二抗抗體37 ℃濕盒中避光作用30 min；漂洗后甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察各組標本熒光強度，并進行半定量分析：無熒光(-)記為0，極弱的可疑熒光(±)記為0.5，熒光較弱但清楚可見(+)記為1，熒光明亮(++)記為2，熒光閃亮(+++～++++)記3～4。

1.6.2 各組大鼠腎皮質LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測 采用Western blotting法。RIPA緩沖液裂解凍存腎組織提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜3次，二抗孵育2 h后洗膜3次，增強化學發光，以β-Actin為內參，采用FluorChem凝膠成像儀掃描成像，AlphaView軟件定量分析。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、Scr、FPG、尿蛋白比較 如表1所示，與A組相比，B、C組大鼠體質量降低，Scr、FPG及尿蛋白水平均顯著升高(P均<0.05)；與B組相比，C組大鼠Scr及尿蛋白水平均顯著降低(P均<0.05)。

表1 各組大鼠體質量、Scr、FPG、尿蛋白比較

注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織病理形態學變化 A組腎小球及腎小管間質無明顯病理改變；B組腎小球體積增大，系膜細胞基質增多，腎小管細胞肥大，出現泡沫樣變、小灶性萎縮、輕度炎性細胞浸潤；C組腎小管及腎小管間質損害較B組明顯減輕，腎小管萎縮及間質纖維化不明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(PASM染色，400×)

2.3 各組大鼠腎小管間質E-cadherin比較 A、B、C組大鼠腎小管間質E-cadherin相對表達量分別為222±37、139±19、192±38，組間相比，P均<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織自噬相關蛋白檢測結果比較

2.4.1 各組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白比較 A、B、C組大鼠腎小管上皮細胞Klotho蛋白熒光強度分別為3.5±0.3、1.5±0.3、2.8±0.6，組間相比，P均<0.05。

2.4.2 各組大鼠腎皮質LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較 A、B、C組大鼠腎皮質LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分別為1.5±0.2、1.0±0.2、2.8±0.6，組間相比，P均<0.05。

3 討論

帕立骨化醇生物學活性與活性維生素D3相似，不僅能降低腎病患者尿蛋白水平，也能抑制腎成纖維細胞的增殖和轉化，減輕腎間質纖維化[6]。Zhang等[7]研究顯示，STZ誘導DN小鼠單用帕立骨化醇治療，可通過抑制腎素轉錄而發揮腎臟保護作用，使用帕立骨化醇與氯沙坦聯合治療，完全避免了蛋白尿的發生，還能修復腎小球濾過屏障，減輕腎小球硬化。也有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加腎小管上皮細胞Klotho蛋白的表達。

本研究中血尿生化指標檢測結果表明，DN大鼠Scr、FPG、尿蛋白水平顯著升高，體質量明顯減輕，經過帕立骨化醇腹腔注射治療后，C組大鼠Scr、尿蛋白水平顯著降低，但體質量較B組無明顯改變；結合PASM染色結果，B組大鼠DN病理改變明顯，而C組腎小管及間質損害較B組減輕，這說明帕立骨化醇可抑制DN腎小管EMT，減輕蛋白尿，改善腎功能。

EMT參與器官、組織的再生及纖維化過程，還可以在惡性腫瘤不受控制的生長中見到。腎臟纖維化最終可導致腎臟功能受損甚至發展為ESRD，其特征包括腎小管上皮向間充質細胞轉化即EMT[8]。人類腎臟纖維化中可見EMT，并且隨著疾病的進展，EMT相關轉錄因子逐漸增強[9]。上皮細胞轉變為間充質細胞的重要原因就是E-cadherin丟失[10]。E-cadherin在各種組織中表達，并參與依賴Ca2+的細胞與細胞之間的互相黏附、連接[11,12]。本研究中，B組E-cadherin表達較A組顯著下降，但C組較B組明顯升高，說明DN可通過調節E-cadherin的表達導致上皮細胞轉變為間充質細胞，進而導致了腎小管萎縮及間質纖維化，而帕立骨化醇可緩解這一過程。

Klotho蛋白在腎臟和腦部表達最多，可通過多種形式發揮生物學功能，在抗老化、抗氧化、抑制細胞凋亡、調節Wnt信號傳導及腎臟離子通道等多種生理和病理過程中發揮著重要作用[13,14]。錢盈盈等[15]研究發現，缺血再灌注急性腎損傷后小鼠腎組織Klotho蛋白表達顯著下調，Klotho蛋白水平的下調可能與凋亡誘導的腎損害密切相關。在本研究中，B、C組Klotho蛋白表達均下降，但與B組相比，C組Klotho表達升高，說明DN可導致Klotho蛋白表達的下降，我們認為DN通過Klotho自噬信號降低了腎小管上皮細胞的自噬作用，進而導致了EMT的發生；而帕立骨化醇可通過抑制DN大鼠Klotho蛋白的表達下降，進而增強腎小管上皮細胞的自噬作用，從而達到預防DN大鼠腎間質EMT的目的。

自噬是溶酶體參與的降解細胞成分的一種途徑，是細胞內維持自身穩態的重要調節機制[16,17]。隨著人們對自噬的廣泛研究，自噬在腎臟疾病中的作用逐漸引起關注。有學者報道[18]，DN動物模型甚至DN患者中發生腎小管上皮細胞自噬障礙，導致本該經自噬溶酶體途徑降解的受損細胞器和胞漿成分等在細胞內累積，可能是加劇腎小管間質的損傷、細胞外基質增多的重要原因。Kitada等[19]研究發現，在DN大鼠腎組織中，近端腎小管細胞自噬受到抑制。本研究中，B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較A組明顯降低，C組較B組升高，提示DN狀態下腎小管自噬減低，而帕立骨化醇可上調自噬水平。

綜上所述，帕立骨化醇能上調腎小管上皮細胞Klotho-自噬信號活性，進而增強DN大鼠腎小管上皮細胞內自噬作用，從而抑制腎小管上皮間充質轉化，減輕蛋白尿，改善腎功能，延緩腎衰竭進展。