mCIM試驗與eCIM試驗在產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯合應用效能

唐克文，李娟，馮麗娜，李從榮

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

耐碳青霉烯類藥物腸桿菌科細菌(CRE)的出現和傳播毫無疑問是一個重要的臨床和公共衛生問題。產碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機制之一，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金屬-β-內酰胺酶(NDM)、維羅納整合子編碼-β-內酰胺酶(VIM)及亞胺培南水解β-內酰胺酶(IMP)是產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌(CP-CRE)最常見的四種碳青霉烯酶，分別由blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP基因編碼，其中KPC屬絲氨酸類碳青霉烯酶，其余均為金屬-β-內酰胺酶[1，2]。多年來，學者們一直致力于尋找碳青霉烯酶的有效檢測方法。2015年，Van der Zwaluw等[3]首次描述了碳青霉烯類失活法(CIM)實驗。2017年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦在實驗滅活期間將無菌水替換為胰蛋白酶大豆肉湯、延長孵育時間，有效提高了碳青霉烯酶檢測的敏感度，即改良碳青霉烯類失活法(mCIM)實驗。2018年，CLSI又將EDTA-碳青霉烯類失活法(eCIM)實驗引入操作指南。eCIM實驗原理基于金屬-β-內酰胺酶必須依賴金屬離子鋅的存在才能有效發揮催化活性，絡合劑EDTA可在細菌孵育期間絡合2價鋅離子，達到抑制金屬-β-內酰胺酶的作用[4,5]。mCIM與eCIM聯合試驗可以區分產金屬-β-內酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌，是一種操作簡便、價格低廉、經濟實用的有效表型檢測方法。本研究通過mCIM試驗與eCIM試驗聯合檢測產碳青霉烯酶腸桿菌，并與基因檢測結果進行比較，探討mCIM試驗與eCIM試驗在產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯合應用效能。

1 材料與方法

1.1 菌株、儀器及試劑 武漢大學人民醫院2016年2月～2017年2月臨床住院患者標本分離的對碳青霉烯類藥物(亞胺培南和/或美羅培南)敏感性降低(最小抑菌濃度≥2 μg/ml)的腸桿菌科菌株80株，其中肺炎克雷伯菌33株、大腸埃希菌19株、產氣克雷伯菌10株、陰溝腸桿菌7株、產酸克雷伯菌5株、弗勞地檸檬酸桿菌3株、摩根摩根菌2株、非脫羧勒克氏菌1株。質控菌株大腸埃希菌ATCC?25922、大腸埃希菌ATCC?35218均購自衛生部臨床檢驗中心，質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-1706均由浙江大學邵逸夫醫院俞云松教授惠贈，質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC?BAA-2146由BD公司惠贈。PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏分析儀購自美國Becton Dickinson公司，T100 PCR儀購自美國Bio-Rad公司，DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠，G:BOX Chemi XT4全自動凝膠成像分析系統購自英國SYNGENE公司，培養基購自廣州迪景公司，EDTA試劑、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)購自杭州濱和微生物公司，藥敏紙片(10 μg/片)購自英國OXIOD公司，2×Taq PCR Master Mix購自上海萊楓公司，PCR引物購自武漢金開瑞公司，DL1000 DNA Marker購自大連寶生物公司，Gel-Red核酸染料購自北京Biotech公司。

1.2 PCR法檢測碳青霉烯酶基因 煮沸法提取細菌DNA模板，設計blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因上、下游引物并委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成，PCR反應體系共20 μL,包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，循環32次，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統中觀察。以DL1000 DNA Marker作為分子量標準，出現明亮條帶且大小在預期范圍判斷為基因陽性[6]。

1.3 mCIM試驗與eCIM試驗聯合應用檢測產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型 ①mCIM試驗。受檢菌株80株。用1 μL接種環取一環過夜培養的新鮮純菌落置于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，35 ℃環境孵育4 h，用10 μL接種環取出美羅培南紙片，貼于已涂布大腸埃希菌ATCC?25922懸液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。抑菌圈直徑6～15 mm或抑菌圈直徑16～18 mm但抑菌圈內有針尖樣菌落為mCIM試驗陽性結果，抑菌圈直徑≥19 mm為陰性結果，抑菌圈直徑16～18 mm或抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落為中介結果。mCIM試驗陽性結果表示菌株產碳青霉烯酶。②eCIM試驗。受檢菌株80株。用1 μL接種環取一環與mCIM試驗對應的新鮮純菌落置于含2 mL TSB肉湯試管中，加入20 μL 0.5 mol/L的EDTA溶液，其余步驟同mCIM試驗，對應菌株的mCIM與eCIM試驗紙片貼于同一MH平板表面。eCIM試驗結果只有當mCIM試驗為陽性結果時有意義，當mCIM試驗為陰性結果或中介結果時，eCIM試驗結果不作解釋[7]。eCIM試驗結果判斷標準：當eCIM試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≥5 mm時為陽性結果，即菌株產金屬-β-內酰胺酶；當eCIM試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≤4 mm時為陰性結果，即菌株產絲氨酸碳青霉烯酶。

1.4 mCIM試驗與eCIM試驗在產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯合應用效能分析 以碳青霉烯酶基因檢測結果為金標準，四格表法計算mCIM試驗檢測產碳青霉烯酶菌株的敏感性和特異性，計算eCIM試驗檢測產金屬-β-內酰胺酶、絲氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性和特異性。敏感性=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%，特異性=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%。分析mCIM試驗與eCIM試驗在產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型檢測中的聯合應用效能。

2 結果

80株菌株中，檢測出攜帶blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因的菌株分別為27株、27株、7株、1株，其中1株肺炎克雷伯菌同時攜帶blaNDM和blaIMP基因，1株產酸克雷伯菌同時攜帶blaKPC和blaNDM基因，1株產酸克雷伯菌同時攜帶blaNDM和blaVIM基因，即產碳青霉烯酶菌株59株。其中32株產金屬-β-內酰胺酶，26株產絲氨酸碳青霉烯酶，1株同時產金屬-β-內酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶，詳見表1。PCR擴增產物電泳圖見圖1。

表1 80株受檢菌株的碳青霉烯酶基因型檢測結果(株)

注：M為DL1000 DNA Marker，條帶1、3、5、7為空白對照，條帶2為blaKPC基因(811 bp)，條帶4為blaVIM基因(370 bp)，條帶6為blaIMP基因(365 bp)，條帶8為blaNDM基因(281 bp)。

圖1 80株受檢菌株的PCR擴增產物電泳圖

80株菌株中，mCIM試驗陽性結果57株，陰性結果23株，即產碳青霉烯酶菌株57株。eCIM陽性結果28株，陰性結果29株，即產金屬-β-內酰胺酶菌株28株，產絲氨酸碳青霉烯酶菌株29株。詳見圖2、表2。

注：A1為產金屬-β-內酰胺酶受檢菌株；A2為產金屬-β-內酰胺酶對照菌株；B1為產絲氨酸碳青霉烯酶受檢菌株；B2為產絲氨酸碳青霉烯酶對照菌株；C1為不產碳青霉烯酶受檢菌株；C2為不產碳青霉烯酶對照菌株；D1為產碳青霉烯酶受檢菌株；D2為產碳青霉烯酶對照菌株；m為mCIM試驗；e為eCIM試驗。

圖2 部分菌株的mCIM試驗與eCIM試驗聯合檢測結果

表2 80株受檢菌株的mCIM與eCIM聯合試驗檢測產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型結果(株)

80株菌株中，59株碳青霉烯酶基因陽性菌株，其中57株試驗菌株mCIM試驗結果陽性，即mCIM試驗檢測產碳青霉烯酶菌株的敏感性為96.6%(57/59)。80株菌株中，21株碳青霉烯酶基因陰性菌株，mCIM試驗結果均陰性，即mCIM試驗檢測產碳青霉烯酶菌株的特異性為100.0%(21/21)。

80株菌株中，33株金屬-β-內酰胺酶基因(blaNDM、blaVIM、blaIMP基因)陽性，其中28株試驗菌株eCIM試驗結果陽性，即eCIM試驗檢測產金屬-β-內酰胺酶菌株的敏感性為84.8%(28/33)。80株菌株中，47株金屬-β-內酰胺酶基因陰性，eCIM試驗結果均陰性，即eCIM試驗檢測產金屬-β-內酰胺酶菌株的特異性為100.0%(47/47)。

80株菌株中，27株絲氨酸碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)陽性，eCIM試驗結果均陰性，即eCIM試驗檢測產絲氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性為100.0%(27/27)。80株菌株中，53株絲氨酸碳青霉烯酶基因陰性，其中51株試驗菌株eCIM試驗結果均陽性，即eCIM試驗檢測產絲氨酸碳青霉烯酶菌株的特異性為96.2%(51/53)。

3 討論

各種類型的CRE中，CP-CRE受到最多的關注，因為它們最有可能造成細菌耐藥性的整體問題。碳青霉烯酶基因攜帶在質粒、轉座子或其他可移動遺傳元件上，促進了革蘭陰性菌之間抗藥性的水平轉移，增加了環境和臨床腸桿菌科細菌的抗性儲存。此外，研究[8]發現，CP-CRE中的質粒通常攜帶額外的抗性元件，具有增加細菌多重耐藥的潛力。目前尚不建議以碳青霉烯類耐藥機制指導治療方案，且碳青霉烯類耐藥機制的檢測在大多數臨床試驗室中并非常規，但CP-CRE的感染常伴隨著較高的治療失敗率及病死率，并且可能需要實施比非CP-CRE更多的感染控制干預措施，因此區分CP-CRE和非CP-CRE對于感染控制和流行病學研究十分重要[9]。Zhang等[10]的研究進行了中國首次全國范圍的CRE檢測，結果顯示產碳青霉烯酶是中國CRE的主要耐藥機制，NDM和KPC-2為主要碳青霉烯酶類型。本研究中，產金屬-β-內酰胺酶菌株占產碳青霉烯酶菌株的55.9%，與相關研究結果一致。然而，迄今為止，臨床常用β-內酰胺酶抑制劑如舒巴坦、克拉維酸、三唑巴坦[11]和新型抑制劑——頭孢他啶-阿維吧坦，對NDM、VIM或IMP等金屬-β-內酰胺酶仍然沒有作用[12，13]。有效的金屬-β-內酰胺酶抑制劑一方面需保證不能破壞人體金屬酶，另一方面應滿足對各種金屬-β-內酰胺酶或同種類型金屬-β-內酰胺酶起作用[14]。面對CP-CRE的感染，區分產金屬-β-內酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶可為抗生素的合理使用提供科學依據。我們認為，研發有效的金屬-β-內酰胺酶抑制劑，尤其是開發靶向NDM和KPC-2的抑制劑是國內抗CRE治療的可行策略。

通過標準藥敏試驗確定菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性后，額外的表型試驗可以幫助確定CP-CRE，包括改良Hodge法(MHT)、Carba NP及其改良試驗、CIM及其改良試驗(mCIM)。另外，有研究[15]報道，基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)對碳青霉烯酶活性的檢測。隨著MALDI-TOF MS儀器在臨床微生物實驗室中逐漸推廣應用，該方法可能會越來越受歡迎，但這些試驗的目標都是針對碳青霉烯酶的產生，沒有提供有關碳青霉烯酶表型的指導。本研究首先通過mCIM試驗完成對產碳青霉烯酶菌株的檢測，與其他試驗相比，mCIM試驗具有重現性好、結果易判讀的優點，不僅具有較高的敏感性和特異性，且對NDM、OXA-48靈敏度更高[16～18]，隨后結合eCIM試驗可檢測出碳青霉烯酶表型。2018年CLSI評價mCIM與eCIM聯合試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬-β-內酰胺酶的敏感性>95%、特異性>92%，本研究中mCIM與eCIM聯合試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特異性與之相符，但檢測金屬-β-內酰胺酶的敏感性較低。我們分析認為，一方面是本研究菌株數量有限，另一方面是eCIM試驗的應用需建立在mCIM的基礎上，本研究中mCIM試驗出現2個假陰性結果，因此2株實際產金屬-β-內酰胺酶菌株的eCIM試驗結果被認為無效，這也體現出了eCIM試驗的局限性，只有確定為產碳青霉烯酶菌株(mCIM試驗結果陽性)時才有意義，不可單獨使用。除此之外，雖然2018年CLSI推薦當mCIM試驗陽性、eCIM試驗陰性時菌株可報告為絲氨酸碳青霉烯酶，但eCIM試驗實際只應用于金屬-β-內酰胺酶的檢測，所檢測菌株同時攜帶其他碳青霉烯酶時則不能區分且可能有假陰性結果，本研究中1株同時攜帶blaKPC和blaNDM基因的產酸克雷伯菌eCIM試驗結果既出現假陰性。

總之，mCIM與eCIM聯合試驗是一種操作簡便、價格低廉、經濟實用的有效表型檢測方法。mCIM與eCIM聯合試驗檢測產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型的敏感性和特異性較高，對流行病學調查、感染控制和抗菌藥物管理優化均具有重要意義。