EB1089對年輕初診系統性紅斑狼瘡患者骨髓間充質干細胞增殖的影響及其機制

徐京京，王曉非

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是以表達自身抗體為特征、多器官多系統受累為表現的自身免疫疾病，免疫功能紊亂是疾病發生發展的核心[1]。近年來SLE骨髓間充質干細胞(MSC)缺陷學說在其機制研究中是一個熱門觀點。免疫細胞及相關因子在輸出骨髓前出現異常，或者說造血干細胞分化、發育成免疫細胞過程中出現缺陷，引起后續SLE疾病發生的連鎖反應是MSC缺陷學說的依據。MSC具有自我更新的屬性和多向分化的潛能，在維持骨髓微環境穩定、免疫抑制及免疫耐受等方面發揮重要作用，但SLE患者MSC可能存在基本屬性缺陷，造成骨髓微環境的紊亂及造血干細胞來源的免疫前體細胞異常，減弱機體免疫抑制及調節作用，導致SLE疾病發生發展，這其中MSC增殖缺陷無疑對MSC的上述作用發揮起到限制作用[2]。研究[3]發現，MSC數量增殖減慢與微環境中活性氧(ROS)蓄積所觸發的早期衰老有密切聯系。維生素D及其類似物具有抗衰老、抗氧化、抑制炎癥、免疫調節、細胞修復等多種藥理學作用。EB1089是一種新型活性維生素D類似物，比生理活性維生素D在細胞增殖、分化等方面發揮更廣泛而重要的作用。本研究觀察了年輕的初診SLE患者MSC本身是否存在增殖缺陷，然后給予EB1089進行干預，觀察EB1089對MSC增殖的影響并探討其機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月～2016年9月在中國醫科大學附屬盛京醫院初次診斷為SLE的年輕患者10例，記為SLE組。SLE組10例患者均為女性，年齡(26.1±2.1)歲，病程3.6(1～9)個月，疾病活動性評分10～14分，病情評估均為中度活動。10例患者從未使用過激素、免疫抑制劑或其他控制病情藥物，排除感染、腫瘤、長期慢性疾病及其他自身免疫系統疾病。同期選取年輕的體檢健康者5例，記為健康組。健康組5例均為女性，年齡(26.2±1.9)歲。兩組患者性別、年齡資料具有可比性。本研究獲中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準。

1.2 MSC細胞的分離、培養及分組 嚴格遵守醫療常規及操作規范，無菌條件下抽取兩組患者髂后上棘骨髓液標本5 mL，肝素抗凝管收集，4 ℃保存。將骨髓液標本移至離心管中，利用加樣管反復吹打形成單細胞懸液，離心后吸取上方脂肪層棄去，向管中加入淋巴細胞分離液Ficoll，分離出單個核細胞，并以5×105/mL接種于25 cm2培養瓶中，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養液后，置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，待細胞融合至80%～85%時進行傳代。SLE組患者分離獲得的MSC記為A組，健康組患者分離獲得的MSC記為B組。

1.3 兩組MSC形態觀察及傳代周期計算 每24～48 h利用倒置相差顯微鏡及其照相系統對兩組MSC的生長速度及細胞形態進行觀察，同時記錄原代(P0代)細胞、第二代(P1代)細胞培養至融合傳代所需時間。

1.4 加入不同濃度EB1089后各組MSC增殖能力觀察 采用MTT噻唑藍比色細胞增殖試驗。取對數生長期的同代A、B組MSC，以1×104個接種于96孔板，分別記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4組，在含5%CO2的37 ℃培養箱中過夜培養使細胞貼壁，隔天換液，分別加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培養基100 μL干預48 h，吸上清，加入新鮮培養液90 μL及MTT溶液10 μL(5 mg/mL)，繼續培養4 h，吸上清，每孔加入DMSO 100 μL，低速震蕩搖晃10～15分鐘，使用酶標儀在490 nm處測量各組MSC的光密度值，以光密度值表示MSC增殖能力。

1.5 加入不同濃度EB1089后各組MSC內ROS檢測 分組方法同“1.4”。各組MSC分別加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培養基100 μL干預48小時，棄去培養基，PBS清洗2次，加入2 mL PBS、5 μL 2′,7′-二氯熒光素二脂(DCFH-DA，10 μmol/L)后，37 ℃培養箱孵育30 min，PBS清洗1次，用胰酶消化細胞，待細胞回縮后加入1 mL培養基終止消化，離心收集細胞，PBS清洗2次，吸入流式管，使用流式細胞儀進行檢測，設置激發波長500 nm、發射波長525 nm，以熒光強度表示MSC內ROS水平。

2 結果

2.1 兩組MSC形態觀察及傳代周期比較 兩組MSC接種后均能在36 h內逐漸貼壁，早期貼壁細胞呈圓形、折光度好，部分細胞周圍有光暈存在；隨著培養時間延長，細胞逐漸出現分裂增生，細胞兩端形成翼狀突起，逐漸變為梭形或不規則多角形，形成大小不等的集落，細胞呈平行排列或渦狀生長，兩組MSC在形態上相似，見圖1。A組P0代細胞培養至融合傳代需(24.9±0.73)d，B組需(14.2±0.66)d，兩組相比，P<0.05；A組P1代細胞培養至融合傳代需(14.2±1.48)d，B組需(7.0±0.70)d，兩組相比，P<0.05。

圖1 兩組MSC形態(×100)

2.2 加入不同濃度EB1089后各組MSC增殖能力比較 A1、A2、A3、A4組細胞光密度值分別為0.258±0.004、0.322±0.009、0.372±0.004、0.438±0.007，B1、B2、B3、B4組細胞光密度值分別為0.448±0.007、0.462±0.022、0.473±0.024、0.484±0.012；A1、A2、A3組與B1、B2、B3組相比，P均<0.05；A4組與B4組相比，P>0.05；A1、A2、A3、A4各濃度組內兩兩相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各濃度組內兩兩相比，P均>0.05。

2.3 加入不同濃度EB1089后各組MSC內ROS比較 A1、A2、A3、A4組ROS熒光強度分別為192.15±10.78、149.69±9.18、139.46±10.05、103.98±11.77，B1、B2、B3、B4組ROS熒光強度分別為75.76±8.34、75.30±7.95、74.61±9.81、74.26±8.46；A1、A2、A3、A4組與B1、B2、B3、B4組相比，P均<0.05；A1、A2、A3、A4各濃度組內兩兩相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各濃度組內兩兩相比，P均>0.05。

3 討論

MSC是一類起源于中胚層、具有多向分化潛能和分泌細胞因子作用的多能基質干細胞，具有強大的免疫調節功能。近年來，在SLE相關機制研究[4]過程中，有學者發現SLE患者可能存在骨髓MSC缺陷，是一種“間充質干細胞病”。研究[5]顯示，體外培養SLE骨髓MSC表現出增殖異常、遷移能力下降、傳代活力與正常MSC相比明顯降低，且傳代過程中易衰老。研究[6]發現，SLE骨髓MSC微絲重構會導致細胞骨架形態異常，影響細胞的生命活動，還能夠誘導ROS聚集、促進細胞凋亡及衰老。同時，還有研究[7]發現，SLE骨髓MSC多向分化受到抑制，自主分泌細胞因子能力異常，致病MSC移植到正常小鼠能夠誘導狼瘡樣癥狀或抗核抗體產生。細胞共培養研究[8]發現，SLE骨髓MSC對T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞免疫調節和免疫平衡作用減弱，誘導免疫耐受能力下降。MSC數量缺陷對SLE骨髓MSC作用發揮無疑有重要的影響，但關于SLE骨髓MSC數量變化的研究結果不完全一致。鑒于以往研究中納入標本多為治療過程中的重癥或難治性病例骨髓標本，不同用藥方案、疾病病程長短、年齡衰老因素對研究結果均可能有一定影響，因此在本研究中收集的病例全部為年輕的初診SLE患者，未應用糖皮質激素或免疫抑制劑及其他改善病情藥物；患者年輕，避免了年齡增加帶來細胞衰老的因素；患者病程相對較短，無長期病程帶來慢性、遠期繼發性損害的風險；病情活動度相對一致，避免了不同疾病活動度對結果的稀釋和中和作用。本研究發現，與B組相比，A組MSC的生長周期、倍增所需要的時間更長，增殖能力顯著降低，但兩組細胞在鏡下基本形態無顯著差異,說明SLE患者的MSC增殖能力缺陷是一種疾病自帶屬性，雖然無法判定其是原發遺傳缺陷還是疾病發生發展中的繼發產物，但這種缺陷在治療前和疾病發生不久就已經存在了，與藥物因素、疾病長病程、年齡導致的細胞退行性改變無關，但不除外上述因素可能會加重這一缺陷。

EB1089是一種新型活性維生素D類似物，除保留生理活性維生素D基本功能外，通過A環的修飾和側鏈結構改造，在細胞增殖、分化方面發揮重要的藥理學作用。研究[9]顯示，低濃度的EB1089能夠促進成纖維細胞增殖，且在濃度極低的作用下也表現出強大的促分化能力，對細胞和組織修復有一定的應用前景，而高濃度的EB1089能夠干預細胞周期，對不同細胞生長有抑制作用。本研究以不同水平低濃度的EB1089干預A組的骨髓MSC，結果發現MSC數量均有明顯增加，與不添加EB1089組比較差異有統計學意義，且隨著藥物濃度的增加，細胞數量增加更為顯著，提示低濃度EB1089促增殖作用具有一定濃度依賴性。

研究[10]顯示，SLE骨髓MSC的數量增殖缺陷是細胞早期衰老的一種表現，體內ROS蓄積在SLE的MSC早熟衰老過程中發揮重要作用。ROS是需氧細胞新陳代謝的產物，同時也是一種信號分子，通過核膜快速轉導，調節細胞內外信號傳遞、基因轉錄、蛋白質表達過程。在外界作用或疾病本身介導下，細胞內外蛋白質重構過程、內質網過度激活反應、線粒體氧化應激及內膜呼吸鏈傳遞受阻均能夠產生大量ROS或造成ROS蓄積。ROS能夠改變細胞通透性，使各種細胞器、核膜等受損，也能直接觸發持續的DNA損傷，或通過多條途徑抑制細胞增殖，所以過量的ROS是觸發DNA損傷反應的關鍵因素，也可能是抑制MSC增殖、誘發MSC衰老的重要原因[6]。研究[11]發現，SLE患者體內ROS的水平較健康人升高，可能與IL-1、IL-6等炎癥因子的分泌激活氧化應激反應有關，也可能與SLE患者體內抗氧化酶活性減弱導致清除ROS能力下降或細胞骨架形態異常誘導ROS積聚增加所致。我們在實驗中發現，A1組MSC內ROS水平顯著高于B1組，進一步用不同水平低濃度的EB1089干預A組的骨髓MSC，發現細胞內ROS水平均有所下降，與EB1089未干預組相比差異具有統計學意義。隨著藥物作用濃度增加，細胞內ROS水平下降也更明顯，提示EB1089抑制活性氧產生作用越強。EB1089具有抗氧化、抗衰老等藥理活性，能雙向調節衰老相關基因和蛋白表達，抑制氧化應激反應，修復DNA損傷，在老年疾病的細胞研究中有諸多證據支持。另外EB1089能夠促進抗氧化酶表達，上調抗氧化系統功能，有促進ROS清除、減少蓄積的作用。我們的研究證明，EB1089能夠抑制MSC內ROS水平，與EB1089干預SLE的骨髓MSC促增殖作用趨勢相一致，提示EB1089促MSC增殖作用可能是通過抑制ROS水平、干擾細胞衰老過程實現的。

綜上所述，初診的年輕SLE患者骨髓MSC存在數量缺陷，與藥物、疾病病程、年齡導致的細胞衰老無關。EB1089可能通過降低MSC內ROS水平、減少DNA持續損傷途徑促進SLE患者骨髓MSC增殖，為維生素D類藥物在SLE患者中的治療應用提供新的理論依據。