Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒基因密碼子使用偏好性分析

王猛，陳莉，靳旺杰，孫朋輝，王莎莎

(1 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州 510515；2 中山大學中山眼科中心/眼科學國家重點實驗室)

脊髓灰質(zhì)炎(簡稱脊灰)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(簡稱脊灰病毒)引起的一種高發(fā)于兒童的急性腸道傳染病，感染脊灰病毒可致患者肢體肌肉出現(xiàn)弛緩性麻痹，并留下終身殘疾，重者可致死亡。脊灰病毒為含有一個開放閱讀框(ORF)的單股正鏈RNA無包膜病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。VP1是脊灰病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是其主要的抗原決定簇，根據(jù)VP1編碼區(qū)域的不同，脊灰病毒可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三個基因型[1,2]。隨著消滅脊灰工作的推進，人類在與脊灰病毒的戰(zhàn)爭中取得了較大的成就。2017年，僅巴基斯坦和阿富汗有脊灰野毒株的傳播，并報告病例22例，達到歷史最低[3]。另外，全球自1999年后未再發(fā)現(xiàn)Ⅱ型脊灰病例，2013年后未再發(fā)現(xiàn)Ⅲ型脊灰野毒株病例，目前流行的脊灰病毒僅為Ⅰ型[4,5]。密碼子是蛋白質(zhì)編碼基因中的基本結(jié)構(gòu)單位，也是生物體遺傳和變異的基本單位。密碼子的使用自認知之初就被標上偏好性的標簽。密碼子使用偏好性無處不在，從病毒到脊椎動物均存在不同的密碼子使用偏好模式，而且近緣物種普遍擁有相似的密碼子使用偏好性[6,7]。對密碼子使用偏好性的分析研究，不僅可用于進一步掌握物種的遺傳和進化信息，并準確預測相關(guān)基因功能，而且還可以發(fā)現(xiàn)基因偏好使用的最優(yōu)密碼子[8,9]。本研究對Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性進行分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 Ⅰ型脊灰病毒毒株基因信息的獲取 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)檢索并篩選出40條Ⅰ型脊灰病毒株的基因信息，見表1。

1.2 Ⅰ型脊灰病毒基因相對同義密碼子使用度(RSCU)值的計算 RSCU是指某一特定的密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的相對使用概率。RSCU值的計算方法為某一密碼子所使用的頻率與其在無偏好性使用時預期頻率之間的比值，計算公式見文獻[10]。如果某一密碼子使用模式無偏好性，則RSCU值=1；如果機體在使用該密碼子時存在偏好性，則RSCU值≠1;另RSCU值≥1.5表示密碼子使用偏好性較強，RSCU值≤0.5表示密碼子使用偏好性較弱。

1.3 Ⅰ型脊灰病毒基因有效密碼子數(shù)(ENc)計算 ENc是密碼子使用偏好性的重要參考指標，其值在20～61。Wright[11]認為，假如一個基因所有的同義密碼子都是平均使用，則該基因的ENc值趨于61，說明密碼子使用偏好性極弱；反之，同義密碼子之間均偏好使用其中特定的一個密碼子，則該基因的ENc值趨于20，說明密碼子使用偏好性極強。ENc值35為一重要臨界點，ENc值<35提示密碼子使用偏好性強，ENc值>35提示密碼子使用偏好性弱。本研究中，Ⅰ型脊灰病毒的ENc采用JEMBOSS 1.5軟件包中CHIPS程序計算得來。

表1 40條Ⅰ型脊灰病毒毒株基因信息

1.4 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析 (C+G)3%是指堿基C和G位于第三位的密碼子占所有密碼子的百分比，該數(shù)值通過CodonW軟件計算得來。之后將獲得的(C+G)3%值與Ⅰ型脊灰病毒的ENc值繪制散點圖，并與(C+G)3%標準曲線進行比較。基因位于(C+G)3%標準曲線上或散布在(C+G)3%標準曲線附近時，說明該基因的密碼子使用模式主要受堿基組成所決定，即密碼子的偏好性受突變壓力影響較大；反之，若基因分布在偏離(C+G)3%標準曲線較遠的位置，則說明其密碼子使用偏好性受自然選擇的影響較大[11,12]。

1.5 不同時間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性分析 采用主成分分析法(PCA)對Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子的RSCU值進行分析，并利用獲得的主因子繪制散點圖，觀察不同時間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子RSCU值 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子的RSCU值見表2。由表2可知，密碼子AGA、AGG、CCA、UCA和GUG的RSCU值均≥1.5，提示Ⅰ型脊灰病毒在這些密碼子的使用上偏好性較強；密碼子GCG、CGA、CGG、CGC、UCG和ACG的RSCU值均≤0.5，提示Ⅰ型脊灰病毒在這些密碼子的使用上偏好性較弱。

表2 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子的RSCU值

2.2 Ⅰ型脊灰病毒ENc值 1～40號Ⅰ型脊灰病毒毒株的ENc值分別是53.710、53.741、53.749、53.137、53.082、52.924、53.370、54.230、53.291、53.506、53.204、53.356、53.705、53.194、53.914、53.276、53.435、54.508、54.038、54.059、54.554、53.338、53.396、53.450、53.401、53.491、53.301、53.810、54.640、53.856、54.414、53.231、53.351、54.090、54.126、54.386、53.404、53.066、53.236、53.345，平均值為53.633，說明Ⅰ型脊灰病毒在密碼子使用偏好性上處于較弱水平。

2.3 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，40株Ⅰ型脊灰病毒毒株均位于(C+G)3%標準曲線以下，并聚集在一起，說明自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性上起主要作用。

圖1 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性

2.4 不同時間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性分析結(jié)果 經(jīng)主成分分析獲得主因子1(Fac1)=19.802和主因子2(Fac2)=18.342，并以此為基礎(chǔ)繪制散點圖，見圖2。由圖2可知：①2009年之前分離出來的毒株均位于圖的下方，提示2009年之前分離出來的Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子使用模式基本相同；②2009年之后，分離于不同國家或地區(qū)的毒株分別聚集于圖的一處，說明其有明顯的地域性，如分離于中東地區(qū)(包括以色列和埃及)和1株巴基斯坦的毒株分布于圖表的右上角，且明顯區(qū)別于其他地區(qū)分離的毒株；分離于非洲地區(qū)(包括喀麥隆、赤道幾內(nèi)亞和乍得)的毒株分布于X軸的遠端，且該區(qū)域僅有非洲分離毒株；分離于中亞地區(qū)(俄羅斯、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦和土庫曼斯坦)的毒株加上3株巴基斯坦的分離毒株聚集于一處，提示2009年之后，不同地域分離出來的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用使用模式不同。

3 討論

雖然我國自1994年后就無脊灰野毒株病例的報道，但WHO至今仍將中國列為脊灰輸入高風險國家，主要原因為2017年全球未阻斷本土脊灰野病毒傳播的國家僅剩尼日利亞、阿富汗和巴基斯坦3個國家，而其中2個國家均與我國接壤。而且隨著海外勞務輸出和進口貿(mào)易的規(guī)模逐年增大，導致脊灰病毒傳入我國的風險居高不下，以致2011年我國新疆維吾爾族自治區(qū)發(fā)生了由巴基斯坦輸入的脊灰野病毒引起的疫情。與此同時，研究人員從急性弛緩性麻痹病例的糞便標本中發(fā)現(xiàn)了疫苗衍生脊灰病毒，說明對脊灰病毒的防范一刻都不能松懈[13,14]。

圖2 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株的主成分分析圖

本研究對40株Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子RSCU值的分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型脊灰病毒在AGA、AGG、CCA、UCA、GUG等密碼子的使用上偏好性較強，在GCG、CGA、CGG、CGC、UCG、ACG等密碼子的使用上偏好性較弱。Ⅰ型脊灰病毒ENc值分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型脊灰病毒在密碼子使用偏好性上處于較弱水平。進一步進行的ENc與(C+G)3%的關(guān)聯(lián)分析，揭示了自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒的進化過程中擔當了主要角色。之后的主成分分析結(jié)果顯示，自然選擇通過地理和時間因素影響了Ⅰ型脊灰病毒的進化方向，尤其是地理因素將不同區(qū)域的毒株隔離開來，即同一區(qū)域分離的毒株在密碼子使用模式上具有較多的相似性，而不同區(qū)域則差異較大。

巴基斯坦作為緊鄰中亞的穆斯林國家，其獨特的地理和宗教因素導致其與中亞以及中東國家有較多經(jīng)濟和文化聯(lián)系[15～17]。2013年，在巴基斯坦同時分離出與中東地區(qū)和中亞地區(qū)相似密碼子使用模式的毒株，意味著Ⅰ型脊灰病毒在巴基斯坦流行毒株的遺傳多樣性[18,19]。近年來，隨著“一帶一路”的提出，中巴經(jīng)濟文化的往來頻繁，兩國關(guān)系不斷升溫，這也加大了我國對脊灰病毒防疫的任務。

綜上所述，Ⅰ型脊灰炎病毒密碼子使用偏好性較弱，自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性上起主要作用，不同時間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用模式差異較大。今后對Ⅰ型脊灰病毒乃至整個脊灰病毒的防疫工作依舊面臨諸多問題和挑戰(zhàn)，也需要科研人員的進一步努力。