lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒構(gòu)建及在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染

陳俊宇，顧欣雨，顧靖釧，魚(yú)敏逸，甘衛(wèi)華，張愛(ài)青

(1 南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210011；2 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

異常增殖的系膜細(xì)胞是腎小球病變中最常見(jiàn)的病理表現(xiàn)，見(jiàn)于各類原發(fā)性與繼發(fā)性腎炎[1]。異常增殖的系膜細(xì)胞可分泌大量炎癥因子引起系膜區(qū)基質(zhì)沉積，最終造成腎臟的不可逆損傷，甚至進(jìn)展為終末期腎病[2,3]。目前臨床上主要通過(guò)免疫抑制劑等藥物控制炎癥因子，但治療效果不理想。研究[4]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)因其較長(zhǎng)的核苷酸序列而擁有多個(gè)功能結(jié)合域與三維結(jié)構(gòu)，能夠在多種分子信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)控作用，這提示了存在某種lncRNA成為系膜細(xì)胞增殖相關(guān)腎病防治的新靶點(diǎn)的可能性。本課題組前期以經(jīng)典的系膜細(xì)胞異常增生模型——TGF-β1處理的大鼠系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，采用高通量lncRNA微矩陣芯片技術(shù)篩選，并在臨床患者腎活檢組織中通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)驗(yàn)證lncRNA-uc.412的特異性，發(fā)現(xiàn)lncRNA-uc.412的表達(dá)水平與系膜細(xì)胞增殖程度顯著相關(guān)，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，lncRNA-uc.412基因全長(zhǎng)268 bp，位于人類17號(hào)染色體q12片段[5]。為進(jìn)一步研究lncRNA-uc.412在系膜細(xì)胞中的潛在作用，本研究構(gòu)建了lncRNA-uc.412的重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細(xì)胞，為探討lncRNA-uc.412在腎小球系膜細(xì)胞異常增殖相關(guān)腎病中作用的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 大鼠腎小球系膜細(xì)胞、大腸桿菌XL-10購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和AluⅠ購(gòu)自Promega公司，TRIzol試劑購(gòu)自ThermoFisher公司，cDNA試劑盒、PCR試劑盒、RT-qPCR試劑盒、高保真DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、嘌呤霉素、質(zhì)粒中抽試劑盒及DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司，β-actin、一抗、二抗均購(gòu)自Proteintech Group公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，pRP[Exp]載體質(zhì)粒(含有EGFP熒光標(biāo)簽、嘌呤霉素抗性基因、CAG真核啟動(dòng)子基因片段)購(gòu)自北京普如汀生物技術(shù)有限公司，PCR上、下游引物購(gòu)自上海捷瑞生物有限公司。

1.2 lncRNA-uc.412的引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增與提取 使用BLAST網(wǎng)站，根據(jù)lncRNA-uc.412基因組序列數(shù)據(jù)的功能編碼區(qū)序列和載體質(zhì)粒pRP[Exp]序列特點(diǎn)，分別選擇限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和AluⅠ作為上、下游引物的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出PCR引物序列：上游引物為5′-CGCGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCGAGCCTGCCTCTTGAAT-3′，下游引物為5′-CCCAGCTACCCTTCATTCAAATCCACACAAGC-3′。通過(guò)TRIzol法提取大鼠腎小球系膜細(xì)胞總RNA，核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計(jì)分析測(cè)定RNA純度和濃度。取1 μg樣品，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明方法進(jìn)行cDNA的合成；取1 μg cDNA加入PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。以10 g/L的瓊脂糖凝膠為電泳介質(zhì)分離出PCR終產(chǎn)物中的目的基因片段，得到大小在200～300 bp的特異性條帶。目的基因片段大小與預(yù)期得到的擴(kuò)增長(zhǎng)度相符，提示成功提取出lncRNA-uc.412基因片段。切取相關(guān)凝膠并通過(guò)回收試劑盒獲取與純化lncRNA-uc.412基因片段。

1.3 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將質(zhì)粒pRP[Exp]與PCR擴(kuò)增所得的lncRNA-uc.412基因片段分別經(jīng)含RsaⅠ和AluⅠ的雙酶體系處理，酶切后產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分離純化，統(tǒng)一收回后混合并加入T4-DNA連接酶，16 ℃過(guò)夜，即獲得lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒。

1.4 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測(cè)序 ①lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定。將大腸桿菌XL-10用42 ℃水浴加熱10 min轉(zhuǎn)至感受態(tài)，4 ℃降溫3 min后，將其與lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒混合，使用移液器轉(zhuǎn)移500 μL含質(zhì)粒與大腸桿菌的混合物至含有嘌呤霉素的LB固體培養(yǎng)基上，涂菌棒均勻涂布，倒置于37 ℃恒溫箱中過(guò)夜后，挑取單克隆菌接種于含1 mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，37 ℃搖菌1 h后，各取150 μL分別接種于含有嘌呤霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中，37 ℃搖菌16 h，根據(jù)質(zhì)粒中抽試劑盒使用說(shuō)明方法裂解細(xì)菌、提取質(zhì)粒，使用Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶處理重組質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒中的lncRNA-uc.412基因片段。將lncRNA-uc.412基因片段與DNA Marker混合進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測(cè)目的基因片段大小。②lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的測(cè)序。選取經(jīng)雙酶切鑒定連接成功的lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增后送往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，使用儀器為DNA全自動(dòng)測(cè)序儀。

1.5 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與觀察 使用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，胰酶聯(lián)合EDTA消化貼壁生長(zhǎng)的腎小球系膜細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度至2×105/L，分別轉(zhuǎn)移2 mL細(xì)胞懸浮液至6孔板中，24 h后觀察到細(xì)胞貼壁后換液，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒pRP[Exp]，分別記為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h后消化收集細(xì)胞，離心去上清后加入DEPC無(wú)菌水，-20 ℃保存。以Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ酶作為上、下游引物的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物序列：上游引物為5′-CTTGAATTCCAAGCAGCACA-3′，下游引物為5′-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3′。通過(guò)TRIzol法提取實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)收集一次熒光信號(hào)以建立擴(kuò)增曲線；95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，監(jiān)測(cè)該反應(yīng)條件下熒光信號(hào)隨溫度的變化并建立溶解曲線以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。用2-ΔΔCt表示大鼠腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測(cè)序結(jié)果 ①lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果顯示，得到大小在200～300 bp的特異性條帶，與lncRNA-uc.412的長(zhǎng)度相符，見(jiàn)圖1。②測(cè)序結(jié)果顯示，lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的堿基序列與理論預(yù)期序列一致，見(jiàn)圖2。

圖1 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物電泳條帶

圖2 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒的部分堿基序列

2.2 lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)觀察 以轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pRP[Exp]的陰性對(duì)照組中大鼠系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對(duì)表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，記為1.00±0.00，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-uc.412的相對(duì)表達(dá)量為8.01±0.97，兩組相比，P<0.05。

3 討論

研究[6，7]顯示，不編碼任何蛋白質(zhì)的lncRNA可作為重要的調(diào)控分子發(fā)揮多種生物學(xué)功能，甚至已有l(wèi)ncRNA被證實(shí)能與某些增殖調(diào)控相關(guān)的信號(hào)因子相互作用，如lncRNA-MEG3可直接與p53基因結(jié)合進(jìn)而激活p53介導(dǎo)的下游反應(yīng)，lncRNA-HULC可通過(guò)HULC抑制miR-15a的成熟而減少PTEN的表達(dá)。lncRNA的作用方式多樣，研究[8～10]顯示，lncRNA一方面能通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與DNA或RNA結(jié)合，激活或沉默靶向DNA的表達(dá)，或者與miRNA形成無(wú)功能結(jié)合從而抑制miRNA的表達(dá)；另一方面，lncRNA憑借其較長(zhǎng)的堿基序列長(zhǎng)度擁有三維結(jié)構(gòu)域與多個(gè)功能域，三維結(jié)構(gòu)能使lncRNA直接結(jié)合蛋白質(zhì)，激活下游蛋白的活性或提高其穩(wěn)定性，多個(gè)功能域的特性使lncRNA能作為誘餌分子招募多種信號(hào)分子的定向聚集并發(fā)生反應(yīng)，這些都是lncRNA-uc.412可能的作用方式與研究方向[11]。

本研究成功構(gòu)建了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶有l(wèi)ncRNA-uc.412基因全長(zhǎng)序列、EGFP熒光標(biāo)簽、嘌呤霉素抗性基因puro、CAG真核啟動(dòng)子。其中，EGFP有利于比較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；嘌呤霉素抗性基因puro有助于質(zhì)粒擴(kuò)展或轉(zhuǎn)染后的篩選；CAG啟動(dòng)子有助于lncRNA-uc.412的高表達(dá)，為對(duì)比觀察lncRNA-uc.412生物學(xué)功能與相關(guān)信號(hào)通路提供基礎(chǔ)。

目前尚無(wú)有關(guān)系膜細(xì)胞增殖相關(guān)腎病與lncRNA-uc.412的研究報(bào)道，而本研究成功轉(zhuǎn)染了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒至大鼠系膜細(xì)胞內(nèi)，并特異性提高了轉(zhuǎn)染后大鼠系膜細(xì)胞的lncRNA-uc.412的表達(dá)水平，該結(jié)果對(duì)于腎病發(fā)生發(fā)展的進(jìn)一步研究有很大意義，為探索系膜細(xì)胞增殖相關(guān)腎病的分子學(xué)相關(guān)通路提供了新的思路。有研究[12]顯示，系膜細(xì)胞雖然不參與濾過(guò)屏障的構(gòu)成，但與血管內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞直接相鄰，三者的病理改變往往引起互相之間的繼發(fā)性損傷，而lncRNA-uc.412的表達(dá)水平與系膜細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，lncRNA-uc.412可能在各種原發(fā)性與繼發(fā)性腎損傷中扮演重要角色。另一方面，lncRNA-uc.412作為作用方式多樣的lncRNA，可能通過(guò)作用于多種信號(hào)通路或在參與病理狀態(tài)下系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控，甚至可能因病理時(shí)期的不同而作用于不同的調(diào)控路徑，出現(xiàn)雙向調(diào)控的特性，如lncRNA H19就被發(fā)現(xiàn)了這種調(diào)控特點(diǎn)。研究[13]結(jié)果顯示，系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控在不同病理時(shí)期涉及多種不同的信號(hào)通路。在增殖前，NADPH氧化酶的啟動(dòng)、轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)的磷酸化、炎癥相關(guān)基因(如TNF-α、IL-6等)的表達(dá)增加，都可促使了系膜細(xì)胞的異常增殖；在增殖過(guò)程早期，血小板衍生因子B直接誘發(fā)了系膜細(xì)胞的增殖與細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加[14,15]；在增殖后期，p53/Caspase-8或PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)了系膜細(xì)胞的自噬與凋亡，從而抑制細(xì)胞過(guò)度增殖并保護(hù)腎功能[16,17]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了lncRNA-uc.412重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細(xì)胞，為進(jìn)一步深入研究lncRNA-uc.412在腎小球系膜細(xì)胞中的生物學(xué)功能與探索腎小球系膜細(xì)胞增殖相關(guān)腎病的防治奠定了基礎(chǔ)。