穩定干擾Drp1基因的慢病毒載體質粒及神經母細胞瘤細胞株構建

周夢琪，柴原，馮琬迪，馬浩潔，蓋聰，孫紅梅

(北京中醫藥大學中醫學院，北京102488)

帕金森病(PD)是一種發病率較高的神經退行性疾病，與環境毒素和遺傳缺陷造成線粒體的異常及線粒體分裂融合的動態平衡被破壞密切相關[1,2]。線粒體的分裂主要由Drp1基因來調控，且分裂的頻率決定了線粒體的形態和功能。因此，Drp1基因與PD的關系越來越被關注和重視。2017年6月8日～2017年7月23日，本研究構建了穩定干擾Drp1基因的重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi，包裝病毒后感染并篩選穩定干擾Drp1基因的神經母細胞瘤細胞株，為進一步研究Drp1基因在PD發病過程中的作用提供了細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y、GV248慢病毒骨架質粒hU6-MCS-CMV-EGFP、大腸桿菌TOP10感受態細胞、293T細胞、慢病毒包裝輔助質粒pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體、嘌呤霉素(REVG1001)、聚凝胺(REVG0001)助感染試劑和Enhanced Infection Solution(REVG0002)感染用培養基均購自上海吉凱基因技術有限公司，T4 DNA連接酶和逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，限制性核酸內切酶購自上海NEB公司，Taq Plus DNA polymerase購自南京Vazyme公司，Lipofectamine 3000轉染試劑、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，無內毒素質粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，THUNDERBIRD qPCR定量檢測試劑購自日本TOYOBO公司，二氧化碳培養箱購自日本SANYO公司，高速冷凍離心機購自美國Thermo Scientific公司，倒置式熒光顯微鏡購自日本Nikon TE2000公司，超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化工程公司，激光共聚焦掃描顯微鏡購自日本Olympus FV1000公司，Safire2全波長熒光酶標儀購自瑞士TEcan公司，PCR儀購自美國ABI公司，測序儀購自美季生物公司，數顯式穩壓穩流電泳儀、凝膠成像儀購自天能公司，CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司，細菌搖床購自華利達實驗設備公司，Blue Pard隔水式恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司，紫外分光光度儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 嘌呤霉素的細胞最低致死濃度篩選 取狀態良好且處于對數生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板中培養24 h，設置實驗組、對照組。實驗組中分別加入1、2.5、5、7.5、10 μg/mL濃度的嘌呤霉素工作液，每個濃度設置5個復孔；對照組不加嘌呤霉素工作液。以不含SH-SY5Y細胞的孔為空白組，采用CCK-8法測算各組細胞存活率，結果顯示，隨著嘌呤霉素濃度增加，實驗組細胞存活率逐漸降低，但當嘌呤霉素濃度為5、7.5、10 μg/mL時，實驗組細胞存活率均小于30%，且三組間細胞存活率相比，P均>0.05，故選取濃度最低的5 μg/mL為嘌呤霉素最低致死濃度進行后續實驗。

1.3 重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi的構建與鑒定 于Gen Bank中檢索人Drp1基因的核苷酸序列(基因編號10059 DNM1L)，利用BLOCK-iTTM RNAi Designer公用設計軟件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/insert.do)設計并篩選最佳動力學參數的干擾序列為：5′-GTGGTGCTAGAATTTGTTA-3′，同時設計作為陰性對照的無關序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，根據靶序列分別設計并合成干擾RNA(siRNA)的單鏈DNA寡核苷酸(DNA oligo)。把合成的單鏈DNA oligo干粉與退火緩沖液配制成終濃度為20 μmol/L 的溶液，90 ℃水浴15 min，自然冷卻至室溫，退火后形成帶黏性末端的雙鏈DNA oligo片段。分別用AgeⅠ與EcoRⅠ雙酶切雙鏈DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架質粒hU6-MCS-CMV-EGFP后，加入T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜，得到重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi和陰性對照質粒。將10 μL重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi加入到100 μL大腸桿菌TOP10感受態細胞中,冰上反應30 min，42 ℃熱激90 s，冰水培養2 min。取適量菌液均勻涂布在含有氨芐霉素的平板上，在恒溫培養箱中倒置培養12～16 h，挑選單個菌落分別接種于LB液體培養基中，置于37 ℃搖床上振蕩培養16 h，按照無內毒素質粒大提試劑盒說明書分別提取質粒DNA，用測序儀對其進行DNA測序，將DNA測序結果與設計的干擾序列進行對比，進一步確定插入序列的正確性。

1.4 穩定干擾Drp1基因的神經母細胞瘤細胞株的建立及鑒定 取對數生長期293T細胞于細胞培養皿中重懸，待細胞匯合度70%～80%時，用Lipofectamine 3000將重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi和輔助質粒(pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體)轉染至293T細胞中，培養48 h后收集上清液，離心后過濾得到Drp1-RNAi重組慢病毒和陰性對照慢病毒，分裝后儲存于-80 ℃冰箱內備用。取對數生長期SH-SY5Y細胞，以5×104/mL接種于6孔板中，分為Drp1-RNAi重組慢病毒組(D組)、陰性對照組(N組)、正常對照組(C組)。D組、N組分別加入Drp1-RNAi重組慢病毒、陰性對照慢病毒和含10 μg聚凝胺助感染試劑的細胞增強液，培養24 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養48 h，再用含5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養基進行篩選，每隔2～3 d換液、傳代，反復篩選2周，熒光顯微鏡下觀察，帶有綠色熒光的細胞即為穩定轉染的細胞株。C組細胞使用普通培養基正常培養。①采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞Drp1 mRNA。收集各組細胞，采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參，進行實時熒光定量PCR反應。引物序列如下:Drp1上游引物為5′-GGTGAAGCGGCAAATCAAACG-3′，下游引物為5′-ATGTTTTGTGTTGATATAAGCCA-3′；β-actin上游引物為5′-CGGCTACAGCTTCACCACCA-3′，下游引物為5′-CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC-3′。建立20 μL PCR反應體系:cDNA 2 μL、power 10 μL、H2O27.2 μL、上下游引物各0.4 μL。PCR反應條件為:95 ℃預變性10 min，40 個循環(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s)。以2-ΔΔCt表示Drp1 mRNA的相對表達量。②采用Western blotting法檢測各組細胞Drp1蛋白。收集各組細胞，使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后封閉1 h，加入相應的一抗，常溫在搖床上孵育1 h后4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3遍，每次15 min，隨后加入相應的二抗孵育1 h，加入ECL化學發光液后采用凝膠成像系統顯像，使用Image J軟件分析條帶灰度值，計算Drp1蛋白的相對表達量。Drp1蛋白的相對表達量=Drp1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi的鑒定結果 DNA測序結果顯示，重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi的DNA序列與設計的干擾序列完全一致，見圖1，提示重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi構建成功。構建的重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi結構見圖2。

注：兩個箭頭之間即為重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi的DNA序列。

圖1 重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi測序結果

2.2 穩定干擾Drp1基因的神經母細胞瘤細胞株的鑒定結果 D組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為0.47±0.12和0.40±0.04，N組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為1.12±0.33和0.67±0.05，C組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為1.02±0.23和0.72±0.02；D組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量與N組、C組相比，P均<0.05；N組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量與C組相比，P均>0.05。

圖2 重組慢病毒載體質粒Drp1-RNAi結構圖

3 討論

PD近年的發病率明顯上升，調查顯示65歲以上人口PD患病率約為1.5%，給社會和經濟發展帶來沉重的負擔[3]。研究[4]表明，線粒體分裂和融合的動態平衡被破壞與PD的發病密切相關。線粒體分裂和融合蛋白大多屬于高度保守的三磷酸鳥苷(GTP)蛋白家族，Drp1是其中調控線粒體分裂的關鍵分子，主要位于細胞漿。在線粒體分裂時，Drp1可被招募到線粒體外膜，富集于線粒體潛在分裂位點，通過GTP水解致線粒體分裂[5]。研究[6]發現，中腦多巴胺神經元被敲除Drp1基因的小鼠可出現PD樣運動障礙，紋狀體內多巴胺樣神經終末和多巴胺的含量明顯減少，其多巴胺神經元內的線粒體明顯變長、運動變慢，軸突終末內線粒體匱乏。研究[7]發現，果蠅中Drp1基因缺失可以引起線粒體的損傷，導致神經肌肉接頭突觸傳遞的障礙，同樣線粒體的損耗影響了ATP生產，神經肌肉接頭處突觸傳遞的能量供應不足?？傊?，Drp1介導的線粒體斷裂與PD發病有著密切聯系。對Drp1的進一步研究，尤其是對它的作用方式和功能的研究，有助于闡明PD的發病機制，也為臨床治療新靶點的發現提供實驗依據。

RNA干擾(RNAi)技術是通過雙鏈RNA高效特異地降解同源基因mRNA，從而抑制細胞內特定基因表達的一種基因沉默技術[8]。目前國內外用于沉默基因表達的RNAi載體種類主要有質粒、腺病毒和慢病毒等，每種載體各有特點。質粒載體的速度快，流程相對簡單，但其轉染效率較低，約為37%左右，且多為瞬時轉染[9]；腺病毒載體包裝容量大，對人致病性低，能夠在增殖和非增殖細胞中感染和表達，但其攜帶的外源基因不易整合到宿主細胞體中，故不能達到持久抑制靶基因表達的效果[10]；慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒為基礎發展起來的基因載體，與一般的逆轉錄病毒載體相比，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可有效地將外源基因整合至宿主染色體上，從而達到持久性表達，具有感染譜廣、感染效率高及穩定表達的優勢[11,12]。本研究選取慢病毒構建了靶向干擾Drp1基因的慢病毒載體，并成功轉染SH-SY5Y細胞。本研究中，嘌呤霉素最低致死濃度篩選、慢病毒載體質粒的構建及測定，為后期獲得穩定干擾Drp1基因的SH-SY5Y細胞模型奠定了基礎，之后進一步采用實時熒光定量PCR和Western blotting檢測Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量，結果提示Drp1的表達被有效抑制，這為進一步了解Drp1與PD的關系奠定了基礎。

綜上所述，為了探究Drp1與PD發病之間的關系，本研究通過構建Drp1基因的siRNA慢病毒載體，建立穩定干擾Drp1基因表達的SH-SY5Y細胞模型，為進一步研究Drp1基因在PD發病過程中的作用環節和機制奠定了模型基礎。