免疫親和柱凈化結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

□ 王 果 郭芳芳 江蘇省理化測(cè)試服務(wù)中心

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是谷物等制品中的常見的一種污染性真菌毒素，是日常飲食中常見的污染霉菌毒素之一；因此靈敏、快速、準(zhǔn)確的分析方法對(duì)保護(hù)人類健康至關(guān)重要[1]。在檢測(cè)工作中小麥粉中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇都是有檢出的。如果食用過量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇會(huì)對(duì)人體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響并會(huì)導(dǎo)致厭食、腹瀉、嘔吐等中毒表現(xiàn)，故脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱為嘔吐毒素。薄層色譜測(cè)定法、免疫親和柱結(jié)合高效液相色譜法、同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇常用的方法[2]。本文使用免疫親和柱結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)小麥粉中的嘔吐毒素，能很好地滿足實(shí)驗(yàn)分析標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器及試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱、紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器（Agilent高效液相色譜儀）、超聲波、渦旋振蕩器、離心機(jī)、真空壓力泵與玻璃注射器。

2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（25 μg/mL）：移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，并存放于4 ℃的環(huán)境中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：準(zhǔn)確移取適量的配制好的儲(chǔ)備溶液，用10%乙腈分別稀釋成濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 小麥粉樣品的前處理

（1）提?。悍Q約2 g（準(zhǔn)確到0.001）的樣品，加入10 mL水渦旋混勻1 min，并超聲后離心，取2 mL上清液。

（2）凈化：將真空壓力泵與玻璃注射器相連接，先將低溫保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，再插到玻璃注射器上，待柱內(nèi)原有液體流至柱體下端1 cm左右后，將2 mL上清液轉(zhuǎn)移至柱中過柱，直至空氣進(jìn)入柱中[3]。用離子色譜水淋洗親和柱，直至空氣進(jìn)入柱中，抽干免疫親和柱，棄去全部流出液。

（3）洗脫：準(zhǔn)確加入1 mL甲醇洗脫免疫親和柱，并收集全部洗脫液至試管中；渦旋30 s混勻溶解殘留物，用0.45 μm有機(jī)濾膜過膜，收集甲醇洗脫的濾液于進(jìn)樣小瓶中以備進(jìn)樣。

3.2 儀器條件及檢測(cè)

3.2.1 液相色譜條件

流動(dòng)相為甲醇∶水（1∶4）；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長218 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；液相色譜柱為C18柱（填料粒徑5 μm，柱長150 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm）。

3.2.2 樣品的檢測(cè)

根據(jù)以上液相色譜條件進(jìn)樣20 μL，采用峰面積定量，保留時(shí)間定性，求出小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的含量。

4 分析結(jié)果

4.1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

免疫親和柱結(jié)合高效液相色譜法根據(jù)色譜條件，得到?jīng)]有拖尾、分離度良好的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖[4]。

4.2 檢出限及線性

相關(guān)系數(shù)及線性回歸方程是根據(jù)5個(gè)色譜標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)峰面積。以3倍的檢出限定義為定量限，在該色譜條件下，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表1。

表1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

4.3 精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收率

本方法采用檢測(cè)小麥粉中的DON，結(jié)果顯示脫氧雪腐鐮刀菌烯醇有檢出。小麥粉中DON含量為120 mg/kg，回收率為90.6%，RSD為2.1%。

5 結(jié)論

使用免疫親和柱凈化結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)小麥粉中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，處理樣品時(shí)工作量小，為檢測(cè)人員檢測(cè)其他谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提供參考。