微生物快檢方法紙片法與平板計數法的對比研究

□ 柴景亮 酒鋼集團甘肅祁牧乳業有限責任公司

關鍵字：食品微生物快速檢測；紙片法；平板培養法

1 研究目的及意義

1.1 研究目的

（1）研究“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）”和“平板培養法”所能夠檢測的菌種。

（2）研究“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）”和“平板培養法”各自的優缺點和特點。

（3）對比“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）” 和“ 平板培養法”之間的不同點及各自的優缺點。

1.2 研究意義

（1）食品微生物快檢這項技術能對食品類產品受到的病原微生物污染程度做出一個十分科學及準確的評價，從而對那些被判定為受到污染的食品產品立案調查，以此作為防治食品安全隱患的重要保障措施。

（2）食品微生物快速檢驗技術進入了現今的“n=5/AC=0”時代后，如何做到快速化、批量化、準確化和經濟化四者兼顧變成了全世界所有檢驗人的研究方向與目的。

2 微生物快速檢驗的范疇及指標

2.1 微生物快速檢驗的范疇

（1）對食品生產環境衛生及消毒情況的檢測，如對其加工過程加工環境的衛生條件把控，工器具等生產加工必需物品的微生物檢驗；對其生產車間（或后廚）的整體衛生指標的檢控等。

（2）對其制作所需原料、輔料的微生物檢驗，包括食用動物、蔬菜、谷物等原料，及用于調味調色等輔料的病原微生物檢驗，防止在食品成品中帶入有害且不易殺滅的微生物。

（3）對用于盛放食品成品的器皿和飲食中所必需的工具進行檢驗，如碗、筷子等餐飲具。

（4）對預包裝食品的包裝工序進行監控及檢驗。

2.2 微生物快速檢驗的指標

2.2.1 菌落總數

菌落總數是指送檢或抽檢的檢樣根據標準規定經過樣品前處理，在適宜被檢菌落生長的條件下（即以盛放有合適培養基的培養皿為容器，以設定好培養溫度和培養時間的培養箱為主要培養環境）培養后，所得的每單位檢樣中微生物菌落的總數量。

2.2.2 大腸菌群計數

該指標是一種常用MPN計數法和平板計數法進行檢驗的項目指標，大腸菌群指在一定的適宜培養條件下可以發酵乳糖并且能夠產酸產氣的需氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌，若大腸菌群指標在同一種（或同一類）檢樣中高出檢出限，則代表該（或該類）產品受到糞便污染的可能性很大。

2.2.3 酵母及霉菌

酵母和霉菌是真菌的一大類，它們廣泛存在于自然界，并且是一種可食用菌，同時，它們也是評價食品衛生指標的指示菌。

2.2.4 其他致病菌

致病菌指進入人類或是動物體內后可能引起人體產生不適感或引發疾病的微生物，包括病原微生物以及部分可以對人產生不良影響的細菌和真菌。如志賀氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、β型溶血性鏈球菌、沙門氏菌與單增李斯特氏菌等。

3 食品微生物快速檢驗的常用方法

3.1 食品微生物快速檢驗的常用方法介紹

（1）快檢紙片法（紙片法）：在使用快檢紙片時，確保除樣品外一切與紙片直接接觸的物品、工具都經過無菌處理，操作人員進行操作時需佩戴頭套、口罩及無菌手套，將紙片取出后，以生理鹽水浸泡，用紙片充分接觸樣品，維持30 s左右，取下紙片，放入培養箱，以37 ℃恒溫培養，一般18 h后便可查看結果。

（2）平板培養法：取樣25 g（液體樣品25 mL）左右，將樣品均質，之后取約1 mL左右的樣品進行無菌培養，按要求加入培養基，2～5天可查看結果。

（3）MPN計數法：在大致確定樣品中待測菌種不多時使用，在樣品處理完成后對其進行系列稀釋，之后取3個連續的稀釋度，分別接種3個培養管，經過2～4天后對照MPN表查看結果。

（4）VITEK法：需要全自動菌落檢定儀，樣品中致病菌經過處理后，用平板劃線培養單個菌落，之后使用儀器進行鑒定，5天左右可查看結果，所需經費高昂。

（5）PCR法：使用聚合酶鏈式反應儀，樣品經處理后上機檢驗，直至找到目標基因，本方法有著極高的靈敏度，但對操作環境、操作人員的要求很高，而且儀器價格不菲，檢驗費用同樣不低。

（6）VIDAS法：同樣是一種快速便捷但對資金要求較高的檢驗方法，VIDAS法要求使用全自動酶聯免疫分析儀，在增菌培養后即可直接進入儀器進行檢驗，且短時間內便可以獲知結果。

本文主要介紹的兩種方法是快檢紙片檢驗法（紙片法）和平板培養法，這兩種方法。

3.2 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）

3.2.1 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的原理

紙片法，即食品微生物快檢紙片法，顧名思義，就是用快檢紙片代替培養基，在紙片的制作過程中將相應的培養基以及用于菌落顯色的顯色物質加入紙片，之后通過快檢紙片和目標樣品的直接接觸，使需要檢測的目標菌附著在經過生理鹽水浸泡的紙片上，此時的快檢紙片已經具備了取代顯色培養基的能力，其上有可供微生物生長的營養物質、用來使微生物顯色的特異性顯色物質以及一部分抗生素。在快檢紙片采樣完成后，只需要將其裝入不封口的無菌袋終，放入培養箱，設定相應的培養時間及溫度后，即可等待結果了。

紙片法中還有一個分支，即紙片擴散法，這是一種以被測試菌和與之對應的抑菌藥物的MIC（指所使用的抑菌藥物與被檢測菌種的最低抑菌濃度）為核心理論原理的檢測方法，而且它也不只用于統計微生物的生長數量與生長狀況，紙片擴散法還可用于測試藥物與相應微生物的敏感程度，多在制藥過程中用到。

3.2.2 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的優缺點

紙片法中使用的微生物快檢紙片是一種一次性即用型檢驗產品，其上所添加涂抹的特異性顯色劑可使目標菌和非目標菌呈現出不同的顏色以供分辨計數，這些紙片都具有良好的吸水性，可以保證微生物在隨著水分被吸入紙片并附著于上時可以分布的更加均勻。紙片法的優缺點和特點如表1所示。

表1 紙片法的優缺點和特點

3.2.3 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的應用

（1）菌落總數檢測紙片：紙片上有膠片覆蓋，輕輕抬起膠片，取大約1 mL樣品在不接觸紙片的前提下滴在紙片上，盡量滴于中央位置，之后小心蓋回膠片，用壓板輕輕壓平，把樣品均勻覆蓋在培養基上，大約1 min后培養基凝膠固化。將紙片放于37 ℃恒溫培養箱內，大約2天即48 h左右可進行計數，細菌于紙片上呈紅色菌落。

（2）大腸菌群檢測紙片：這種紙片基本用于外出抽檢等工作，其紙片上自帶有培養基和一定的營養物質，保證它可在相對較為復雜的戶外環境中進行檢驗。幾乎所有de 大腸桿菌都能產生β-葡萄糖苷酸酶，當它們吸附于紙片上時，便能與紙片上的葡萄糖苷酸酶指示劑發生反應，伴隨有少量氣泡并在大腸桿菌周圍生成藍色沉淀；而當大腸菌落吸附于紙片上時，會在紙片上產酸，而紙片上自帶的pH指示劑會使其上添加的培養基變成暗紅色。紙片在采樣后需放置在37 ℃恒溫培養箱中培養18 h左右即可看到明顯的變色反應。所以這種紙片只需一次檢驗，就可以由不同的顏色分布得出大腸菌群及大腸桿菌的數量。

紙片法一般用于食品微生物快速檢驗和抽樣檢驗中，食品微生物快檢紙片有菌落總數檢測紙片、霉菌和酵母菌檢測紙片、大腸菌群及大腸桿菌檢測紙片和金黃色葡萄球菌檢測紙片。

3.3 平板培養法

3.3.1 平板培養法的原理

平板培養法是利用瓊脂、明膠等凝膠型固體培養基制成一個平面，之后在這個平面上培養微生物或培養多細胞生物的細胞、組織、器官等，它的原理是微生物在固體培養基上的單個菌落是由同一細胞繁殖而成。

平板培養法有3個分支，它們分別是稀釋混合平板法、稀釋涂布法和平板劃線分離法等等，各自有各自的特點和優缺點，也適用于不同要求的樣品。

而在食品微生物檢驗方面，多用稀釋混合平板法和平板劃線分離法來進行檢驗。

3.3.2 平板培養法的優缺點

相較于紙片法，平板培養法的優缺點更為明顯，平板培養法中的三種培養方法都有其各自的優缺點和適用范圍。