細胞（蠟）塊聯合免疫細胞化學技術通過胸腔積液檢測診斷惡性腫瘤的價值

王占東，卓 靜，李 菲，繆曉丹，王 濤，時 瑤

胸腔積液是晚期惡性腫瘤患者常見的臨床并發癥狀，臨床多采用穿刺抽取積液以減輕癥狀，并進行常規細胞學檢查。大多數病例會得到明確診斷，但對于原發灶不明、無法通過內鏡活檢、體外穿刺及手術切除獲得組織標本的病例，胸腔積液細胞病理學診斷可能是這類患者能確診的選擇方法。傳統涂片明顯不能滿足要求，臨床迫切需要從胸腔積液獲得明確診斷，采取精準治療，因此胸腔積液進行細胞蠟塊結合免疫細胞化學技術檢測應運而生，并迅速發展，筆者收集近兩年的病例，進行回顧性總結。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年1月—2018年12月徐州市腫瘤醫院收治的406例胸腔積液患者作為觀察對象，所有患者均經過該院影像學診斷、穿刺確診為胸腔積液患者；所有患者均進行傳統涂片細胞學檢查，其中陰性161例、僅見少許異型細胞38例，高度可疑癌36例，發現癌細胞164例，其他惡性腫瘤7例。其中56例診斷不明確或已診斷為癌而臨床需要進一步分型的患者，進行細胞蠟塊及免疫細胞化學技術檢測。

1.2方法

1.2.1傳統涂片制作方法 采集患者漿膜腔積液標本 200～500 ml，迅速送往細胞室。 取出 20 ml，置離心管中，2000 r/min，離心10 min，棄去上清，取出沉渣，采用推拉法制片2張/例，待其自然風干之后，使用瑞特-吉姆薩雙染色法進行染色處理。

1.2.2細胞塊制作方法 把剩余的漿膜腔積液，靜止后，棄上清，留存50 ml，震蕩后移入離心管內，2000 r/min，離心10 min離心兩次后離心管中加入10%中性甲醛10 ml，室溫固定處理1 h后，棄上清，使用吸管將細胞塊放置于顯微鏡擦鏡紙上，包好后放入包埋盒，置于自動脫水機中進行處理，做成石蠟細胞塊。進行常規石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察。

1.2.3免疫細胞化學采用En Vision法 一抗雌激素受體廣譜細胞角蛋白 （pan-cytokeratin，CKpan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF-1、NapsinA、Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等均購自北京中杉生物技術有限公司。陽性判斷標準：相應部位出現棕黃色顆粒。操作步驟均按說明書進行。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件處理數據，率采用（%）表示，比較用 χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

56例胸腔積液患者，男18例，女38例；年齡25～86歲，中位年齡69歲。傳統涂片法查見癌細胞，即陽性37例；未查見癌細胞，即陰性5例；查見異型或可疑癌細胞，即不確定14例。胸腔積液細胞蠟塊結合免疫組織化學染色結果顯示，陽性47例（包括轉移性肺腺癌43例，鱗狀細胞癌2例，乳腺癌1例，卵巢漿液性癌1例），陰性9例。其中2例傳統涂片診斷為癌，而細胞塊加免疫細胞化學證實為增生的間皮細胞，14例不確定者，其中9例證實為癌，5例為陰性。后者陽性檢出率高于前者，且不確定構成比低于前者（表1）。兩種方法檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=5.556，P＜0.05），見表 2。

細胞塊石蠟切片中轉移性肺腺癌細胞常常成團聚集，邊緣光滑的三維立體的細胞球最常見，也可以呈梅花狀、乳頭狀和腺腔，核漿比增大，核異型，核染色質細膩（圖1），背景可見少許炎細胞，使癌細胞非常突出，或背景夾雜大量增生間皮細胞，與癌細胞不易區別（圖2）。造成形態學診斷困難。

表 1 傳統涂片與細胞塊+免疫細胞化學檢出率比較［例（%）］

表 2 兩種方法檢出率與漏檢率比較［例（%）］

免疫細胞化學染色：轉移性癌表達廣譜細胞角蛋白（pan-cytokeratin，CKpan）、BerEP4，同時轉移性肺腺癌細胞 TTF-1（圖 3）、NapsinA（圖 4）陽性；鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性；乳腺癌 ER、PR及GATA3 陽性；卵巢癌 WT-1、PAX8、CA125 陽性。而增生的間皮細胞表達 CK5/6、Calretin、WT-1等抗體。

圖1～4見封三。

3 討論

胸腔積液是臨床常見病癥，其良惡性判定對疾病的診斷、治療及預后有重要的臨床意義。如何利用胸腔積液判斷是炎癥反應、間皮增生、間皮瘤、還是轉移性腫瘤，是臨床關心的問題，如果能同時判斷轉移性腫瘤的來源及類型，亦是臨床診斷及治療的需要。胸腔積液離心后制成細胞涂片，進行細胞學診斷是最常用的方法，已開展多年，也解決了很多實際問題，但尚不能滿足需要，免疫組織化學是外科組織病理學最常用的診斷技術，其結果有助于確診腫瘤的良惡性、組織來源及組織亞型。如何把免疫組織化學應用于細胞學，現在有多種方法，其一是細胞涂片退染后，免疫細胞化學染色；其二采用同時制備多張涂片進行免疫細胞化學染色的方式；還有一種就是現在逐漸被認可并用于實際工作的細胞塊加免疫細胞化學技術方法［1-3］。

細胞塊（cell block，CB）制備是指將細胞懸浮液離心，得到高度濃縮的細胞和微小的組織塊，再經由固定、脫水、透蠟和石蠟包埋等操作后得到的可長期保存的細胞蠟塊。現在常見的細胞塊制備方法主要有直接法（離心管沉淀制備法、冷凍細胞團蠟塊制備法、試管包埋法、載玻片細胞聚集制備法）和間接法（瓊脂細胞塊制備法、蛋清細胞塊制備法、凝血酶一血漿細胞塊制備法、HistoGel制備法、Collodion bag（ColB）制備法）［4］，筆者采用了最簡單直接的離心沉淀法，富集有核細胞層制備細胞塊，具有細胞數量較多，背景清晰，染色鮮艷，核漿對比清晰，組織結構也保存得比較完整等優點［5］。同時細胞塊易于保存，可連續切片，便于進行免疫細胞化學染色，其免疫細胞化學染色背景清晰，著色均勻，陽性定位準確，顯色明確，資料可長期保存，使細胞學具有組織病理學的特點［6］。如有需要還可以進行基因檢測［7］。

胸腔積液需要確定是炎癥反應，間皮瘤，還是轉移性腫瘤，因此需要一組標志物，進行鑒別診斷，常 用 的 是 CK （pan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF -1、NapsinA、Calretin、WT -1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等多種抗體標志。對于胸腔積液中常見的轉移性肺腺癌CK （pan）、TTF-1、NapsinA 是常用的標志物［8］，鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性；乳腺癌ER、PR及GATA3陽性；卵巢癌WT-1、PAX8、CA125陽性。而增生的間皮細胞表達CK5/6、Calretin、WT-1 等 抗 體 。 其 中 WT-1（Wilm’s tumor gene）在增生間皮細胞、間皮瘤及轉移性卵巢漿液性癌中呈核陽性，轉移性惡性黑色素瘤胞漿陽性。而組織細胞、淋巴細胞、轉移性肺腺癌、乳腺癌、胃癌等呈陰性［9］。CK（pan）在間皮與癌細胞均有表達，需要 Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4 等多種抗體聯合應用，才能鑒別診斷。該組病例，未見報道中的惡性黑色素瘤，淋巴瘤，如有需要，應用于組織蠟塊的免疫細胞化學抗體，在細胞塊中也適用。

該實驗結果顯示，細胞塊結合免疫細胞化學技術方法對于胸腔積液的陽性檢出率明顯高于傳統涂片，且對于轉移癌能進一步明確來源及類型，細胞塊具有可長期保存的優勢，因此細胞塊結合免疫細胞化學技術方法對于提高細胞學診斷準確性有很大幫助，應用于宮頸及非婦科液基細胞學的細胞塊結合免疫細胞化學技術方法已有報道［10］，不斷總結經驗，提高細胞學診斷水平。