睪丸顯微取精術聯合卵胞漿內單精子顯微注射治療非梗阻性無精子癥的臨床效果

甘賢優 零瀟賓 舒金輝 周 紅 楊 嫚

(廣西壯族自治區婦幼保健院生殖中心，南寧市 530003，電子郵箱：2671302431@qq.com)

無精子癥約占男性不育因素的10%～20%[1]，臨床分為梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)，其中約有60%的患者為NOA[2]。自1998年Schlegel成功施行睪丸顯微取精術(microdissection testicular sperm extraction，MD-TESE)以來，該術式逐漸成為治療NOA的有效方法[3-4]。而MD-TESE聯合卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可有效提高NOA患者生育后代的機會[5]。我中心近年來為30例NOA患者施行MD-TESE術，并對部分獲得精子的患者實施ICSI助孕治療，取得較好的臨床療效，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年10月至2018年4月在我中心施行MD-TESE術的NOA患者30例，年齡23～44(33.3±4.9)歲。納入標準：(1)符合NOA的診斷標準：按照《人類精液檢查與精子-宮頸黏液相互作用實驗室手冊》[1]規定，不少于3次精液常規檢查提示離心沉淀后鏡檢未找到精子；同時遵照歐洲泌尿外科協會男性不育癥指南(2015年版)[6]的要求，NOA的診斷基于標準的臨床檢查程序，包括病史、體格檢查、精液常規分析、精漿生化檢查、血清生殖激素分析、超聲評價、染色體核型分析和無精子因子(azoospermia factor,AZF)檢測等；(2)近期無泌尿系感染或生殖系統感染；(3)無相關手術禁忌證。排除標準：(1)梗阻性無精子癥患者；(2)低促性腺激素綜合征患者；(3)高泌乳素血癥患者；(4)AZFa區或AZFb區缺失患者；(5)配偶卵巢功能衰竭患者。30例NOA患者中，特發性無精子癥患者20例，克氏綜合征患者4例，AZFc區缺失患者5例，雙側隱睪固定術后患者1例。

1.2 治療方法

1.2.1 MD-TESE手術:采取硬膜外麻醉，取陰囊正中縱向切口，依次切開皮膚、肉膜及鞘膜，暴露并擠出一側睪丸，避開血管沿睪丸赤道線水平橫行切開白膜，充分暴露睪丸組織，置于手術顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號：YZ20T4)下仔細觀察各個區域，用鑷子逐個區域認真分離和探查，如發現發育較好、管壁較厚、飽滿的曲細精管，則將其完整牽拉或切除，置于盛有Quinn 1006精子洗滌液的培養皿內送至男科實驗室，由專業技術人員采用機械法粉碎后在倒置顯微鏡(×400)下尋找精子。如未找到精子，同法探查另一側睪丸。仔細檢查無出血后用6-0微蕎線連續縫合白膜，將睪丸復位，依次逐層縫合手術切口。如雙側睪丸均未發現精子者，將獲得的曲細精管組織繼續在培養液中培養24 h后再次觀察有無精子。

1.2.2 保存睪丸精子：采用稀少精子凍存技術冷凍保存睪丸精子。把機械法粉碎的曲細精管混合物轉入200 μL的EP管中，室溫下200 g離心5 min，去上清，加入1 ∶1稀釋的Quinn 8020精子冷凍液，輕輕震蕩混勻，在液氮面4～5 cm處熏蒸4 min，直接置入液氮保存，并做好標識、登記。

1.2.3 ICSI治療:共有10對夫婦實施ICSI治療。女方按常規方法采用促性腺激素釋放激素激動劑長方案或加尼瑞克拮抗劑方案促排卵，當優勢卵泡直徑≥18 mm時，于當晚注射人絨毛膜促性腺激素5 000～10 000 IU，34～36 h后取卵。按常規方法用雙腔取卵針穿刺雙側卵巢，超聲引導下吸取卵泡。將獲得的卵泡液置于體式鏡(×10)下，獲取卵冠丘復合物，將卵冠丘復合物置入Quinn受精液[含5%人血清白蛋白的1020(SAGE，美國)]中培養，2～4 h后去除顆粒細胞；同時將丈夫凍存的睪丸精子復蘇，復蘇成功后用于MⅡ期卵子ICSI治療，16～18 h后觀察有明顯雙原核和雙極體者判斷為正常受精卵，則移入Quinn卵裂液[含10%血清蛋白代用品的1026(SAGE，美國)]中培養，于第3天移入Quinn囊胚培養液[含10%血清蛋白代用品的1029(SAGE，美國)]中培養至移植。

1.3 觀察指標 MD-TESE術后，觀察患者睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平。觀察行ICSI術患者受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率。隨訪至分娩，記錄流產、早產、足月產、嬰兒健康或畸形等情況。(1)優質胚胎評價標準：卵裂速度正常，細胞大小均一或略有不均，形狀基本規則，碎片≤20%，第2天無多核現象。(2)妊娠：胚胎移植后常規使用地屈孕酮和黃體酮軟膠囊支持，移植后14 d檢測血β人絨毛膜促性腺激素，確定是生化妊娠；移植后5周行B超檢查，如發現子宮內有孕囊及心管搏動者確定為臨床妊娠。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 獲精情況 30例NOA患者均實施MD-TESE手術，獲得精子13例，獲精率為43.3%(13/30)。其中特發性無精子癥患者獲精率為50.0%(10/20)，克氏綜合征患者獲精率為50.0%(2/4)，AZFc區缺失患者獲精率為20.0%(1/5)，雙側隱睪固定術后獲精率為0%(0/1)。

2.2 MD-TESE術后不同結局患者相關觀察指標對比 根據MD-TESE術后是否獲得精子將30例患者分為獲精組13例和非獲精組17例，兩組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 獲精組與非獲精組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素、睪酮水平比較(x±s)

2.3 ICSI治療結果 13例獲得精子患者中共10對夫婦施行ICSI治療。MⅡ期卵子數為7～17(10.9±4.0)個，受精率為(74.8±15.7)%，優質胚率為(41.2±17.5)%，臨床妊娠率為70.0%(7/10)；有4例足月分娩5名健康嬰兒，3例早期稽留流產，見表2。

表2 ICSI治療結果

3 討 論

NOA患者根據其促性腺激素水平可分為低促性腺激素性、正常促性腺激素性和高促性腺激素性三種類型。低促性腺激素性NOA常見的病因有特發性低促性腺激素性性腺功能減退癥和Kallmann綜合征，患者可通過內分泌治療恢復自身生育力；正常促性腺激素性NOA大多數病因不明，部分患者與 Y 染色體微缺失有關，臨床病理主要表現為睪丸生精阻滯；高促性腺激素性NOA臨床較常見，病因包括：(1)先天因素，如無睪癥、隱睪癥、Klinefelter綜合征等；(2)獲得性因素，如外傷、睪丸扭轉、精索靜脈曲張、炎癥、藥物、放射線和腎衰竭等；(3)特發性因素，即由不明原因所致。后兩種類型NOA尚無明確有效的藥物治療方法，患者大多選擇使用“供精”助孕或領養的方式獲得后代。

Palermo等[7]于1992年首次應用ICSI技術治療男性不育獲得成功，使NOA患者獲得自己的遺傳學后代成為可能。Devroey等[8]研究表明，通過手術獲取 NOA 患者的睪丸精子，結合ICSI技術可使卵子成功受精，從而使NOA患者獲得遺傳學后代。NOA患者獲取睪丸精子最初是采用睪丸取精手術，主要包括睪丸切開取精術和睪丸細針穿刺抽吸術。1998年Schlegel等[3-4]首次報告在手術顯微鏡下可發現NOA患者睪丸組織有少部分發育較好的曲細精管，其中存在局灶的生精區域。隨后，MD-TESE手術作為一種新的睪丸取精術式不斷應用于NOA患者的臨床治療，并取得較好的臨床結局。相較于傳統的睪丸取精手術，MD-TESE手術可借助手術顯微鏡能夠區別不同的生精小管，避免“盲目”取精對睪丸產生損傷，同時提高獲精率，更具針對性和高效性。Schlegel[4]對563例NOA患者共行684次MD-TESE手術，獲精率為61%，臨床效果滿意。越來越多的研究證實，與傳統睪丸取精術相比，MD-TESE手術可有效幫助NOA患者確定睪丸內是否存在精子，可提高獲精率，降低手術并發癥，是目前最為有效的NOA患者外科取精技術[9]。

本組30例NOA患者均施行MD-TESE手術，結果獲得精子13例，獲精率為43.3%，獲精組與非獲精組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平比較均無差異(均P>0.05)，提示MD-TESE術獲精與否與患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平無關。Ishikawa等[10]采用MD-TESE聯合ICIS治療1 275例NOA和隱匿精子癥患者，共進行1 323次MD-TESE手術，獲精率為42.5%，且獲精率與患者促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平均不相關，與本研究結果相一致。NOA患者的睪丸體積能否作為預測MD-TESE手術獲精率的指標尚存在爭議。Golpi等[11]研究發現，睪丸體積≥12 mL時，NOA患者獲精率為61.11%，8 mL≤睪丸體積<12 mL時，獲精率為48.21%,睪丸體積<8 mL時，獲精率為42.19%,提示睪丸體積大則獲精率高。但趙連明等[12]研究發現，NOA患者睪丸<8 mL時獲精率為57.4%(58/101)，睪丸體積>10 mL時獲精率為31.6%(24/76)。Ramasamy等[13]研究認為，睪丸體積大小并不是預測MD-TESE手術獲精率的指標，小睪丸可能只代表精子發生不良，但無法預測局灶性生精小管的存在。本研究結果提示，獲精組與非獲精組患者睪丸體積比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示睪丸體積可能不是MD-TESE手術獲精率的預測指標。

雖然NOA患者行MD-TESE手術成功獲取精子，但患者夫婦能否生育還取決于ICSI治療結果。本文有10例獲得精子的患者采用復蘇的睪丸精子實施ICSI治療，受精率為(74.8±15.7)%，優胚率為(41.2±17.5)%，臨床妊娠率為70.0%(7/10)，其中4例足月順產5個健康嬰兒，3例早期稽留流產，表明采用NOA患者復蘇的睪丸精子實施ICSI治療，能夠獲得較高的受精率和臨床妊娠率。Aydin等[14]研究證實，NOA患者與梗阻性無精子癥患者施行MD-TESE手術獲取睪丸精子后實施ICSI治療,兩者受精率、臨床妊娠率相似。本研究有7例獲得臨床妊娠，結果有3例自然流產，因此應該重視NOA患者的遺傳風險，應與患者夫婦做好溝通，在其充分知情同意的前提下實施治療。

綜上所述，MD-TESE手術可幫助NOA患者確定睪丸內是否存在精子，獲精率高。MD-TESE聯合ICSI治療NOA能獲得較好的臨床結局，是NOA患者生育遺傳學后代的有效治療方式。