非標記定量蛋白質組技術篩選早期糖尿病腎病大鼠的尿蛋白標志物▲

覃保瑜 劉 紅 黃 鴻 姚彥冰 方 丹 夏 寧

(1 廣西醫科大學第一附院老年病學內分泌代謝科，南寧市 530021，電子郵箱：qinby100@163.com；2 廣西壯族自治區衛生健康委員會，南寧市 530021)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性并發癥，在我國有20%～40%的糖尿病患者并發DN[1]。DN與心腦血管疾病發生發展密切相關，也是導致終末期腎臟病的主要基礎疾病[1]。臨床上DN的防治措施是早期診斷、早期治療，目前早期DN是以微量白蛋白尿(microalbuminuria,MA)[即尿白蛋白與肌酐比值(urine albumin-to-creatinine ratio,UACR)值為30～300 mg/g]為診斷標志物。但MA的診斷價值仍有不足：對于合并MA的糖尿病患者，在10年后僅有30%～45%的患者發展為大量白蛋白尿，30%的患者出現自然轉陰，與腎病隨病程的進展不符；糖尿病腎小球的病理改變常在出現MA之前；部分糖尿病患者已出現腎功能不全但其尿白蛋白水平正常[2-3]。因此，尋找早期DN的新診斷標志物一直為臨床所關注。近年來，基于質譜的蛋白質組學成為研究疾病診斷標志物的重要方法，通過對組間差異蛋白的分析，可篩選出早期DN新的尿蛋白標志物[4]。直接以糖尿病患者尿液進行蛋白質組學實驗，易受所入選病例質量等多種因素干擾而影響實驗結果[5]。本研究應用非標記定量蛋白質組技術篩選早期DN大鼠的尿蛋白標志物，為下一步臨床驗證研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級Wistar大鼠16只和動物飼料均由廣西醫學實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK桂2011-0002)，10月齡，雄性，體重(280±20)g，自由攝食和飲水，20℃室溫飼養。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素、ProteoPrep? Blue Albumin & IgG Depletion去高豐度蛋白試劑盒(批號：S0130、PROTBA)購自Sigma公司；超濾離心管購自Millipore公司(批號：UFC903024)；蛋白酶抑制劑混合片購自Roch公司(批號：04693124001)；Bradford蛋白質定量試劑盒購自江蘇碧云天公司(批號：P0006)；2-D Clean-Up試劑盒(批號：80648451)、EttanTMMDLC型多維液相色譜系統購自GE Healthcare公司；配備電噴霧電離源的Finnigan LTQ線性離子阱質譜系統購自Thermo Fisher Scientific公司；胎球蛋白A酶聯免疫吸附法試劑盒購自Abcam公司(批號：ab205074)。

1.3 糖尿病模型的制備 適應喂養1周后，采用隨機數字表法將16只大鼠分為正常對照組和糖尿病模型組，各8只。禁食12 h，糖尿病模型組大鼠腹腔注射小劑量(25 mg/kg) 鏈脲佐菌素(鏈脲佐菌素溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，pH 4.5)，72 h后測鼠尾端末梢血糖并連續監測1周，8只糖尿病模型大鼠隨機血糖均持續≥16.7 mmol/L，提示糖尿病模型建模成功。正常對照組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。

1.4 尿液標本收集 成模1周后收集糖尿病模型組大鼠的尿標本，測UACR，此后每隔4周測1次UACR，至第24周時測UACR達30～300 mg/g。依據UACR結果，將大鼠糖尿病成模前、成模后1周、成模后24周分別設為非糖尿病(non diabetes,ND)期、正常白蛋白尿(normal albuminuria,NA)期、MA期，分別收集24 h尿液。用代謝籠收集正常尿標本，取2 mL尿液，采用免疫比濁法測定尿白蛋白，用酶法測定尿肌酐，計算UACR；收集24 h尿液后，8 000 r/min、 4℃離心10 min，去沉淀，收集上清，放入蛋白酶抑制劑混合片(1片藥配10 mL尿液)，-80℃冰箱保存。

1.5 非標記定量技術分析NA期和MA期尿液差異蛋白 本部分實驗在中國科學院上海生命科學研究院中科新生命實驗室研究人員的指導下完成。(1)尿標本超濾離心和濃縮[6]：于冰箱取出尿標本，冰上凍融后移入截留3000分子量的15 mL超濾離心管，加去離子水，4 500 r/min、4℃離心45 min，重復3次。為避免尿液中高豐度蛋白和非蛋白雜質對檢測結果的干擾，分別用去高豐度蛋白試劑盒和2-D Clean-Up試劑盒，以層析法去除尿液樣品中高豐度的白蛋白和球蛋白，以及鹽分、脂類、酚類和核酸等非蛋白雜質，嚴格按說明書操作。采用Bradford法進行蛋白質定量。處理后的尿標本分裝成10 μg一管，-80℃冰箱保存。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳粗分離蛋白和膠內酶解[7]：取20 μg處理后的尿樣品上樣后，經由12.5%分離膠和5%濃縮膠組成的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，考馬斯亮藍R250染色，掃描。每個泳道切成8份，取每份凝膠樣品，進行標準膠內酶解，酶解后樣品合并成4份。(3)液相色譜-電噴霧電離串聯質譜:胰酶酶解肽段經多維液相色譜系統進行反相高效液相色譜分離，將2 h梯度洗脫出的蛋白肽段經LTQ離子阱進行串聯質譜分析，每個樣品的酶解產物質譜分析各重復3次。(4)非標記差異定量分析：原始文件用DeCyder MSTM2.0進行統計分析，對蛋白質譜的峰面積進行非標記差異定量分析，采用t檢驗，以P<0.05篩選差異肽段分子；用BioWorks軟件的SEQUEST算法鑒定多肽分子，采用的過濾參數為當Charge+1時Xcorr≥1.9，當Charge+2時Xcorr≥2.2，當Charge+3時Xcorr≥3.75，其中DelCN≥0.1。利用Swiss-Prot/TrEMBL數據庫(https://www.uniport.org/)和NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查詢差異肽段分子所對應的(大鼠)蛋白質。采用BuildSummary軟件對所有鑒定的蛋白質進行整合和比較，輸出搜庫結果，篩選出專一性肽段數≥2的蛋白列表。利用MA期與NA期兩期間差異肽段所鑒定的差異表達蛋白的相對比值來分析尿蛋白的表達變化，為減少假陽性，本實驗將相對比值≥2為表達顯著上調蛋白質，相對比值≤0.6為表達顯著下調蛋白質。

1.6 酶聯免疫吸附法確認尿蛋白標志物 選取MA期表達顯著上調的感興趣的尿蛋白質胎球蛋白A做進一步確認試驗，采用酶聯免疫吸附法進行檢查，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，所得濃度(μg/L)以隨機尿肌酐水平(g/L)校正，比較各組尿胎球蛋白A/尿肌酐比值。

1.7 腎組織病理學檢測 建模24周后，兩組大鼠經隔夜空腹后，以10%水合氯醛麻醉后處死，取左腎部分皮質，采用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片行糖原染色，組織病理學檢測，光鏡下觀察兩組大鼠腎組織的病理變化。

1.8 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，多組均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NA期和MA期大鼠尿液的差異表達蛋白 本研究每組尿蛋白樣品均經液相色譜-電噴霧電離串聯質譜重復3次，其結果經DeCyder MS軟件轉化為二維圖譜，經比對顯示具有高度相似性，說明實驗數據重復性好，適合非標記定量分析。成功鑒定的尿蛋白179個，篩選出專一性肽段數≥2的蛋白共51個。其中，與NA期比較，MA期表達顯著上調的蛋白質共15個，表達顯著下調的蛋白質共12個。見表1。

表1 專一性肽段數≥2的51個表達差異蛋白質信息

續表1

2.2 MA期候選尿蛋白標志物的確認 與NA期比較，在MA期除尿微量白蛋白外，以尿胎球蛋白A表達上調較顯著(相對比值=3.13)，因此選取尿胎球蛋白A作MA期大鼠的候選尿蛋白標志物，進一步作確認實驗。結果顯示，ND期、NA期、MA期的尿胎球蛋白A/尿肌酐比值分別為(0.26±0.08 )μg/g、(0.31±0.09)μg/g、(0.59±0.15)μg/g，差異有統計學意義(F=24.564，P<0.05),其中MA期的尿胎球蛋白A/尿肌酐比值均高于NA期、ND期(均P<0.05)。

2.3 腎組織病理學檢查 以正常對照組大鼠腎組織作為對照，光鏡下，糖尿病模型組MA期大鼠腎小球增大，毛細血管基底膜增厚，系膜細胞及系膜基質增多，可見腎小管上皮細胞空泡變性，部分腎小管擴張或灶狀萎縮，間質大量炎癥細胞浸潤，呈早期DN的病理改變。見圖1～2。

圖1 正常對照組大鼠腎組織(PAS染色,×400)圖2 MA期大鼠腎組織(PAS染色,×400)

3 討 論

生物標志物常用于疾病診斷(包括臨床療效判斷)，它可以是蛋白質、核酸、糖化合物、脂類化合物及小分子物質等。動物和人體尿液富含蛋白質，其來源于全身循環和泌尿系局部組織，蘊含機體豐富的生物學信息。尿液采集簡單、無創、來源豐富，是研究腎病理想的生物標志物來源。蛋白質組學可通過“組學”方法分析生物體液內所含的蛋白質信息，基于質譜(MS)的蛋白質組學技術是目前尿液生物標志物研究的熱點。通過定量技術比較兩組或多組間的差異蛋白，從而篩選標志物是蛋白標志物研究的最新方法，常用的技術路線是蛋白樣品經過液相色譜分離后聯合串聯質譜分析，借助相關軟件，應用生物信息學等技術分析和鑒定蛋白質。蛋白質組的定量技術主要分為標記(主要是同位素)定量技術和非標記定量技術，非標記定量技術具有靈敏、快速、可用于多組間比較等特點，與標記定量技術相比較，其成本低、程序簡單，且不以降低可信度為代價[5]。

本研究中尿蛋白組學的分離及質譜技術路線為：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳聯合液相色譜-電噴霧分離蛋白后，連接LTQ離子阱質譜進行串聯質譜分析，然后采用非標記定量技術分析結果。最終成功鑒定的尿蛋白179個，其中專一性肽段數≥2的蛋白51個，與NA期比較，在MA期胎球蛋白A、轉甲狀腺素蛋白、激肽原-1、S100-A8蛋白、α-1-酸糖蛋白、a-1微球蛋白、維生素D結合蛋白等15個尿蛋白表達顯著上調，而尿調素、α-3型Ⅳ型膠原、凝膠溶素等12個尿蛋白表達顯著下調。而光鏡下可見MA期腎臟組織呈早期DN的病理改變，因此這些表達差異的尿蛋白應被視為早期DN候選尿蛋白標志物，值得進一步研究。

近年來，相繼有有關DN尿蛋白標志物的蛋白質組學的研究報道。其中，Schlatzer等[8]比較糖尿病大鼠2個月病程組和糖尿病初發組尿差異蛋白，發現2個月病程組的胎球蛋白A、激肽原-1、S100-A8蛋白、α-1-抗蛋白酶等尿蛋白表達顯著上調，尿調素、前表皮生長因子、激肽釋放酶-1、載脂蛋白A1等尿蛋白表達顯著下調；Siwy等[9]報告，與2型糖尿病患者的正常MA期比較，MA期的胎球蛋白A、激肽釋放酶-1、α-1-抗蛋白酶、轉甲狀腺素蛋白等尿蛋白表達顯著上調；Marikanty等[10]發現，與2型糖尿病患者的正常MA期比較，MA期的胎球蛋白A、α-1-酸糖蛋白、β-2-微球蛋白、胱抑素B及轉甲狀腺素蛋白等尿蛋白表達顯著上調。但由于尿蛋白含量非常豐富，而蛋白質組實驗的研究設計、樣品制備、蛋白分離和質譜的儀器平臺、生物信息學等均與蛋白鑒定結果密切相關，這些客觀因素均會影響各個研究結果的一致性。將本研究結果與其他研究結果進行比較后發現，尿胎球蛋白A在糖尿病患者和糖尿病大鼠的MA期或早期DN表達均顯著上調。胎球蛋白A是一種多功能糖蛋白，分子量約64 KD，主要由肝臟合成并分泌進入外周循環。血漿胎球蛋白A水平升高與胰島素抵抗、糖尿病及動脈粥樣硬化等相關[11-12]，而其低水平與血管鈣化和炎癥相關[13]。但血漿胎球蛋白A能否作為DN等微血管并發癥的標志物尚存爭議[14]。經質譜和生物信息學方法鑒定的蛋白質，需經特異性的蛋白質抗原-抗體結合試驗(如酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡法等)進行確認，因此本研究采用酶聯免疫吸附試驗對尿胎球蛋白A進行確認檢測，結果顯示，早期DN尿胎球蛋白A水平明顯增高，提示尿胎球蛋白A或可作為早期DN的診斷標志物。糖尿病患者尿胎球蛋白A升高可能與肝臟的合成分泌增多、腎小球基底膜損傷及腎小管的重吸收變化有關[15]，但具體機制未明。

本研究用非標記定量蛋白質組技術篩選出早期DN大鼠的尿蛋白標志物，其中尿胎球蛋白A對早期DN的診斷價值值得進一步研究。