自動化抗酸染色系統與手工染片法檢測性能的比較

袁曉華，左 芳

(1.鄂東醫療集團黃石市中心醫院/湖北理工學院附屬醫院臨床輸血科，湖北黃石 435000;2.武漢科技大學，湖北武漢 430000)

肺結核是結核分枝桿菌(MTB)引起的肺部疾病。世界衛生組織統計，2016年全球有1 040.00萬例新發結核病例，且37.40萬人死于MTB[1]。我國在2011年第5次結核病流行病學抽樣調查結果也顯示，結核病發病人數約為130萬人，占全球發病人數的14.3%[2]；每年因結核病而死的患者人數達13萬人，是僅次于印度的世界第二大結核病高發國家[3]，而且人類免疫缺陷病毒(HIV)死亡患者中有1/3是由肺結核感染引起的[4]。因此，結核病的早期準確診斷和治療在防治中起著關鍵的作用[5]。根據肺結核的診斷標準，結核病的病原學檢查是結核病確認病例的必備條件[6]。而抗酸染色又是國內大多數醫院用于檢測體液或組織中抗酸桿菌的主要方法[7]。同時抗酸染色檢查還存在操作復雜、技術要求高等缺點[8]。因此，黃石市中心醫院(下稱本院)運用自動染片系統進行抗酸染色，期望達到與手工抗酸染色一樣的檢測性能，且能縮短檢測時間，提高檢驗效率。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3月本院呼吸內科普通住院患者的樣本300例，其中痰樣本233例，肺泡灌洗液67例。

1.2儀器與試劑 Mycol T STAINER自動染片系統及配套抗酸染液(批號2016121301)購自上海皓信生物科技有限公司。TXD3細胞涂片離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。手工抗酸染液試劑盒(批號415091)購自珠海貝索生物技術有限公司。BX41顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3方法

1.3.1痰液的樣本處理 每例患者取清晨第一口痰，先用清水漱口，再用力咳出深部痰液0.5～3.0 mL于無菌痰杯內，及時送檢。將專用竹簽從中折斷，用斷處的茬面挑取樣本中的膿樣、干酷樣、血樣等可疑部分，在玻片正面垂直均勻涂抹成10 mm×20 mm卵圓形痰膜。自然干燥后，將玻片5 s內置于火焰上烤4次進行固定。每個樣本制片2張。

1.3.2支氣管肺泡灌洗液的樣本處理 收到呼吸內科纖支鏡室送檢的支氣管肺泡灌洗液樣本后，將試管輕輕顛倒混勻，取0.9 mL灌洗液加入細胞涂片離心機的漏斗中，2 000 r/min,離心10 min，拿出漏斗和濾紙，取下制好的涂片。自然干燥后，同痰樣本一樣固定。每個樣本制片2張。

1.3.3抗酸染色 手工染片法，首先滴加石炭酸復紅，染色30 min后水洗，接著用3%鹽酸乙醇脫色2次，每次1 min，2次脫色都用水洗。最后用美藍復染0.5 min后水洗，自然干燥，記錄用時。自動染片法，將涂片分批插入自動染片機的轉盤中。選擇數字后按開始鍵，染片機集染色、加熱、脫色、復染、干燥于一體，染色完成后記錄用時。每次手工法或自動法染色時用自制的陽性質控片進行質量控制[9]。陽性質控片預先準備，用臨床抗酸桿菌陽性程度+++～++++的痰液涂片制作，熱固定后不染色，置于密閉的玻片盒內于4 ℃冰箱內儲存。

1.3.4閱片 采用雙盲法對300例樣本的600張玻片用油鏡進行鏡檢，根據《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[10]和上海地區綜合性醫院結核病實驗診斷操作規范[9]。觀察300個視野，鏡下見抗酸桿菌為陽性，未見為陰性，只統計陰、陽性，不統計陽性程度。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料以例數表示，采用Fisher′s確切概率法。用成組χ2檢驗，P<0.05為兩種染色方法的結果有相關性。用配對資料的McNemar檢驗，P<0.05為兩種染色方法的差異有統計學意義。用Kappa檢驗來分析兩種染色方法結果之間的一致性，P<0.01為一致性有統計學意義，當Kappa值≥0.75時為一致性好，0.75>Kappa值≥0.4時為一致性一般，Kappa值<0.4時為一致性較差。以樣本陽性率為對照組，兩種方法各自的陽性率為實驗組，繪制兩種方法的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計算曲線下面積(AUC)。

2 結 果

2.1相關性 233例痰和67例肺泡灌洗液用手工法和自動法平行進行抗酸染色。手工法檢出痰陽性10例，灌洗液陽性9例，陽性率分別為4.29%和13.43%。自動法檢出痰陽性9例，灌洗液10例，陽性率分別為3.86%和14.93%。成組χ2檢驗，痰樣本χ2=163.1，P<0.01，灌洗液樣本χ2=59.26，P<0.01。說明兩種方法的染色結果有相關性。

2.2McNemar檢驗 檢驗結果痰和灌洗液的P>0.05，為兩種抗酸染色法，結果的差異無統計學意義，Kappa檢驗，檢驗結果痰和灌洗液P<0.01，Kappa值分別為0.835、0.939，為兩種抗酸染色法的一致性有統計學意義，且一致性好。見表1、2。

表1 兩種方法染色233例痰樣本的結果

表2 兩種方法染色67例灌洗液樣本的結果

2.3診斷效能 設兩種染色方法其中任意一種陽性，即認定為樣本陽性，計算樣本陽性率，痰和灌洗液的樣本陽性率分別為4.72%和14.93%。以樣本陽性率為對照組，以兩種方法各自的陽性率為實驗組，繪制ROC曲線。手工法和自動法的AUC都為0.952，見圖1和表3。說明手工法抗酸染色和自動法抗酸染色的診斷效能相同。

圖1 兩種方法染色300例樣本的ROC曲線

2.4用時比較 300例樣本，手工法平均用時46 min/n，自動法平均用時12 min/n，自動法比手工法節省74%的耗時。

表3 兩種方法染色300例樣本的AUC和P值

3 討 論

目前，臨床上已經有了幾種新的方法能快速診斷結核分枝桿菌，如實時熒光定性PCR在檢測低排菌量標本時具有明顯優勢[11]。只是檢測成本較高，在一些經濟欠發達的地區并不適用[12]。抗酸染色檢測因其較高的特異度、方便快捷的可操作性、生物安全要求低，在診斷分枝桿菌的感染中仍起著重要的臨床作用[13]。有文獻指出，抗酸染色的檢測性能與多色巢式實時熒光定量核酸擴增法(Xpert MTB/RIF)的符合率為90.93%[14]。它作為一個傳統的方法仍不可丟棄[15]。痰涂片抗酸染色還是判定結核患者預后的重要臨床監測指標[16]。韓瑩等[17]報道，近幾年抗酸染色涂片陽性患者逐年遞增，提示受感染者有擴大的趨勢。因此，如何準確、快速地進行抗酸染色檢測，仍是臨床研究的目標。

本文收集了233例痰樣本。另外考慮到普通痰樣本的陽性率低，陽性樣本太少，因此又收集了67例陽性率較高的肺泡灌洗液樣本。使用手工法和自動法各染色涂片300張，采用雙盲法進行閱片比較。結果，痰和灌洗液樣本，手工法陽性率分別為4.29%和13.43%。自動法陽性率分別為3.86%和14.93%。成組χ2檢驗說明兩種方法的染色結果有相關性。McNemar檢驗說明兩種方法染色結果的差異無統計學意義，Kappa檢驗說明兩種方法的一致性有統計學意義，且一致性好。另外，設兩種染色方法其中任意一種陽性即認定為樣本陽性，計算樣本陽性率，以樣本陽性率為對照組，手工法和自動法的陽性率為實驗組，繪制ROC曲線。結果手工法和自動法的AUC都為0.952。兩種方法的ROC曲線完全重合，雖然由于樣本量小的原因，這種重合有著偶然性。但也說明了手工法抗酸染色和自動法抗酸染色的診斷效能相同，自動化抗酸染色系統可以代替手工抗酸染色法進行臨床檢測，與戴蕓等[18]研究的結論一致。

自動染片系統耗時短，染色過程僅8～12 min。比手工法節省74%的用時。每次可同時染12或24片，另外，全封閉系統，集加熱、甩干一體，不需要接近水池。比起手工法，使用染料少，污染環境小。因此，本文認為，運用自動染片系統進行抗酸染色，由于其操作簡便，耗時短，較容易建立標準化，診斷效能和手工法相同，提高了檢驗效率，值得臨床推廣。