多囊卵巢綜合征患者血清和卵泡液中Adropin水平對胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響

奚 迪，鄭英霞，劉 斌，匡樂樂，任懿倩，高玉平△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)中心；2.檢驗科,上海 200092)

夫婦同居且有正常性生活，未避孕1年以上未受孕稱為不孕癥[1]。《中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》指出，我國不孕不育癥患者高達(dá)15%～20%，且有年輕化趨勢[2]。

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡女性最常見的婦科內(nèi)分泌疾病，根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[3]，我國育齡婦女患病率為5.6%[4]。PCOS以稀發(fā)或無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣變?yōu)樘卣鱗5]，嚴(yán)重影響了女性的生育能力。而尋求輔助生殖技術(shù)(ART)助孕的PCOS患者通常臨床結(jié)局較差，易發(fā)生卵子成熟障礙、受精障礙等問題。

2008年KUMAR等[6]發(fā)現(xiàn)由能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因(Enho)編碼的分泌性蛋白Adropin，但其詳細(xì)作用機(jī)制及機(jī)體代謝途徑尚未明確[7]。在以往的研究中，Adropin已被發(fā)現(xiàn)在與PCOS相關(guān)疾病如代謝綜合征[8-9]、糖尿病[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]及心血管疾病[12-13]中具有臨床應(yīng)用價值，推測它在PCOS相關(guān)的不孕癥中也具有研究前景。

本研究旨在分析PCOS患者的血清和卵泡液中Adropin的表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)的關(guān)系，及對體外受精(IVF)胚胎質(zhì)量的預(yù)測價值，為臨床早期預(yù)計PCOS患者ART結(jié)局提供實驗依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2017年9月至2018年8月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心首次進(jìn)行IVF助孕的患者共60例。受試者均簽署知情同意書。

PCOS組納入標(biāo)準(zhǔn)主要參照2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[5]，同時參考PCOS中國診療指南：患者必須有月經(jīng)稀發(fā)或無排卵或不規(guī)則子宮出血。另外再符合高雄激素血癥(臨床性和生化性)或卵巢多囊樣病變中的1項，同時逐一排除可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)庫欣綜合征；(2)非經(jīng)典型先天性腎上腺皮質(zhì)增生(NCCAH)；(3)卵巢或腎上腺分泌雄激素的腫瘤；(4)功能性下丘腦性閉經(jīng)；(5)甲狀腺疾病；(6)高泌乳素血癥；(7)早發(fā)性卵巢功能不全(POI)。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：因輸卵管因素進(jìn)行IVF助孕、月經(jīng)周期和排卵有規(guī)律的不孕癥患者；年齡匹配、促排方案與PCOS組一致，同時排除PCOS及其他可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病。

所有患者需同時排除：(1)男方重度少精、弱精、畸形精子癥等男性因素不育；(2)重度子宮內(nèi)膜異位癥；(3)既往卵巢病變史或卵巢手術(shù)；(4)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤；(5)遺傳病家族史；(6)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)禁忌證。

1.2研究方法

1.2.1促排卵方案 所有患者采用拮抗劑方案進(jìn)行促排卵。自患者月經(jīng)第3天，B超卵巢處于基礎(chǔ)狀態(tài)，開始每天肌肉注射促性腺激素(Gn)：重組人促卵泡素 r-FSH(普利康600 IU/支，MSD)。根據(jù)患者體質(zhì)量肌肉注射150～250 IU/d，用藥5 d后，根據(jù)卵巢的反應(yīng)[B超監(jiān)測卵泡大小及血清促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P)水平]調(diào)整Gn劑量，當(dāng)優(yōu)勢卵泡≥14 mm或LH≥10 IU/L時加用拮抗劑(思則凱0.25 mg/支，MerckSerono) 0.25 mg/d至人絨毛促性腺激素(HCG)日(包括 HCG日)。

1.2.2觸發(fā)方案 當(dāng)至少1個卵泡直徑≥18 mm或2個卵泡直徑≥17 mm，結(jié)合血清E2、LH和P水平?jīng)Q定停用促性腺激素。若患者中重度卵巢過度刺激征(OHSS)的發(fā)生風(fēng)險不高，給予肌肉注射HCG 5 000～10 000 U，具體劑量根據(jù)HCG日的卵泡數(shù)量決定。肌肉注射HCG 35～36 h后在陰道B超引導(dǎo)下取卵，卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)4～6 h后進(jìn)行常規(guī)體外受精或單精子胞漿內(nèi)注射。取卵當(dāng)日給予黃體支持，肌肉注射黃體酮針劑 80 mg/d。

1.2.3標(biāo)本采集 分別在患者促排卵周期的月經(jīng)第3天、HCG日以及取卵日早晨8點(diǎn)肘靜脈采血3.0 mL，1 000×g離心15 min后取血清標(biāo)本，分裝后于-80 ℃保存待測；取卵日通過B超下細(xì)針穿刺術(shù)穿刺患者第一個優(yōu)勢卵泡，獲得無稀釋、未被血液污染的第一管卵泡液，經(jīng)實驗室撿卵后充分混勻，1 000×g離心15 min后取上清液，分裝后于-80 ℃保存待測。

1.3儀器與試劑 采用全自動微粒子化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑(貝克曼庫爾特，美國)運(yùn)用酶化學(xué)發(fā)光法檢測血清E2、LH、卵泡生成素(FSH)、P、催乳素(PRL)、睪酮(T)和胰島素(INS)水平；采用全自動生化分析儀及配套試劑(日立，日本)運(yùn)用己糖激酶法檢測血清葡萄糖(Glu)水平；采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑(西門子，德國)檢測血清促甲狀腺激素(TSH)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(華美生物，中國武漢)檢測血清及卵泡液Adropin水平(賽默飛世爾酶標(biāo)儀，美國)。

1.4方法 按儀器及試劑說明書操作。使用人Adropin(ENHO)酶聯(lián)免疫試劑盒檢測Adropin水平：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，于包被ENHO抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的ENHO抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣本中的ENHO呈正相關(guān)性。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(A值)，計算樣本水平。

2 結(jié) 果

2.1PCOS患者的Adropin水平及臨床參數(shù) PCOS組患者基礎(chǔ)LH值、空腹INS水平、HCG日E2值明顯高于對照組，HCG日FSH值、血清和卵泡液中的Adropin水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 PCOS患者的Adropin水平及臨床參數(shù)

2.2取卵日PCOS患者Adropin水平 血清中Adropin水平明顯高于卵泡液中水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PCOS患者中Adropin水平顯明低于對照組中水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

注：Ser為血清，F(xiàn)ol-F為卵泡液,Con為對照組。其中*表示P<0.001

圖1取卵日PCOS患者血清及卵泡液中Adropin水平

2.3PCOS患者IVF胚胎培養(yǎng)結(jié)果 PCOS組的獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和可移植胚胎數(shù)顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；PCOS組卵子利用率低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但優(yōu)質(zhì)胚胎率和正常受精率兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PCOS患者IVF胚胎培養(yǎng)結(jié)果

注：卵子利用率=可移植胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)或卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%[14]。

2.4PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關(guān)性分析 血清和卵泡液中Adropin水平與BMI、基礎(chǔ)LH值、LH/FSH值、空腹胰島素、獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，但與基礎(chǔ)E2值、基礎(chǔ)及HCG日FSH值呈正相關(guān)性(P<0.05)；此外，血清Adropin水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、HCG日E2值、多PN受精率呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，但與正常受精率呈正相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表3 PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關(guān)性分析(ng/mL)

續(xù)表3 PCOS患者Adropin水平與臨床參數(shù)及胚胎質(zhì)量的相關(guān)性分析(ng/mL)

注：HOMA-IR=Glu×INS/22.5；卵子利用率=可移植胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)或ICSI注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%[14]

3 討 論

Adropin參與人體能量代謝、調(diào)節(jié)脂類的生成、維持體內(nèi)葡萄糖的平衡并增加胰島素的靈敏度，但其機(jī)制仍不十分明確[15]，在預(yù)測輔助生殖治療結(jié)局中的作用也尚無定論。PCOS是育齡女性常見的婦科內(nèi)分泌疾病，是引起無排卵性不孕癥的主要原因，本研究的主要目的是探討血清和卵泡液中的Adropin水平對PCOS患者在輔助生殖治療中胚胎發(fā)育的預(yù)測價值。

PCOS患者的促排卵方案調(diào)節(jié)了Gn使用劑量，但由于PCOS患者竇卵泡數(shù)較多，最終獲卵數(shù)也顯著高于對照組，該基數(shù)的增多提高了PCOS組正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和可移植胚胎數(shù)。本研究顯示PCOS患者的卵子利用率低于對照組，這與PCOS患者體內(nèi)的高LH水平和低FSH水平有關(guān)，過量分泌的LH與低于正常量的FSH易造成卵泡閉鎖并過早黃體化，導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良和排卵障礙，卵母細(xì)胞的成熟度下降直接對卵子利用率產(chǎn)生不良影響，卵子利用率低下會降低胚胎的正常受精、優(yōu)質(zhì)胚胎和囊胚形成的比例，在獲卵數(shù)相近的情況下，PCOS患者每周期最終獲得可用胚胎的數(shù)量減少，同時也減少了移植和妊娠的機(jī)會。

在本研究中，兩組患者卵泡液中Adropin的表達(dá)均低于血清水平，與BOUSMPOULA等[16]的研究結(jié)果一致。Adropin主要合成于人類肝臟、腦組織等一些外周組織，又經(jīng)血清-卵泡屏障過濾，導(dǎo)致卵泡液中Adropin濃度較低。與對照組相比，PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平顯著降低，與部分研究結(jié)果一致[16-18]。PCOS患者存在肥胖、葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗等代謝紊亂現(xiàn)象，Adropin通過激活葡萄糖氧化的限速酶-丙酮酸脫氫酶，能夠提高細(xì)胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)，同時下調(diào)對丙酮酸脫氫酶有抑制作用的丙酮酸脫氫酶激酶4，促進(jìn)胰島素誘導(dǎo)PI3K/PKB的磷酸化，從而提高機(jī)體對胰島素的敏感度，降低IR導(dǎo)致的卵泡發(fā)育停滯、月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)的情況，提高患者的生育力。本研究顯示Adropin水平與HOMA-IR的呈負(fù)相關(guān)性，提示Adropin對PCOS患者卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能具有正面的作用，推測高Adropin水平可能改善胚胎質(zhì)量與不孕癥治療效果。

血清Adropin水平與BMI的相關(guān)性目前存在爭議，本研究顯示PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平與BMI呈負(fù)相關(guān)性，與其他報道結(jié)果一致[10,19]，另有一些研究者發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)性[16,20]或無相關(guān)性[21]。

本研究另一結(jié)果表明，血清Adropin水平與PCOS患者正常受精率呈正相關(guān)性，與多PN受精率呈負(fù)相關(guān)性。多PN受精又稱為多精受精，其原因主要是受精時有兩個或兩個以上的精子穿入卵子，體外授精后16～20 h可觀察到受精卵含有大于或等于3個原核(多見3PN)，是異常受精的類型之一。多PN的受精卵普遍不能正常發(fā)育，胚胎易早期死亡，通常棄去不用于移植。有研究證實，PCOS患者的ART不良結(jié)局在胚胎培養(yǎng)方面表現(xiàn)為受精率下降[22]，主要原因與卵母細(xì)胞質(zhì)量低下及胚胎發(fā)育潛能不足有關(guān)。如果胚胎受精率異常，應(yīng)首先分析卵子成熟度是否有異常。Adropin作為能量調(diào)節(jié)因子，參與PCOS病情的發(fā)生發(fā)展，低Adropin表達(dá)加重患者的能量代謝紊亂，從而引起的卵母細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力低下和線粒體功能障礙，影響了卵母細(xì)胞成熟所需的細(xì)胞質(zhì)的儲備、受精中卵母細(xì)胞的激活和胚胎的早期正常發(fā)育。ICSI注射前通過剝除顆粒細(xì)胞可以直接觀察到卵子的第一極體的排出情況(MⅡ率)，作為評估卵子成熟度的指標(biāo)之一，用于預(yù)測ICSI正常受精率[23]。但I(xiàn)VF無法提前預(yù)知MⅡ率，大大降低了預(yù)測IVF正常受精率的效果。而PCOS患者血清Adropin水平的降低，提示了IVF方式下，患者的正常受精率可能下降，多PN受精率可能增高，導(dǎo)致可利用胚胎數(shù)減少，ART結(jié)局差。另有研究者報道，ICSI周期的3PN率為5.0%，遠(yuǎn)低于IVF周期的33.9%[24]。因此，對于低Adropin水平的不孕癥患者，胚胎實驗室可以改變授精方式，實行ICSI受精，以確保正常受精卵母細(xì)胞的比例，最大限度實現(xiàn)對卵母細(xì)胞的利用。

鑒于本研究的患者僅限于首次行IVF治療的患者且數(shù)據(jù)數(shù)量有限，后期還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并增加PCOS患者治療前后Adropin水平變化及相應(yīng)的IVF結(jié)局情況，以進(jìn)一步證實此結(jié)論。此外，今后還應(yīng)當(dāng)對患者的移植妊娠結(jié)局及新生兒情況進(jìn)行隨訪，以進(jìn)一步分析研究Adropin對IVF-ET結(jié)局的預(yù)測價值。

4 結(jié) 論

血清Adropin水平與PCOS患者的卵母細(xì)胞發(fā)育及受精情況存在一定相關(guān)性，對預(yù)測患者胚胎質(zhì)量、選擇授精方式具有參考意義，提示胚胎實驗室進(jìn)行早期干預(yù)以提高患者可用胚胎的數(shù)量與質(zhì)量。