河蟹酶解液Maillard反應揮發性風味成分HS-SPME-GC-MS分析

張慧慧，盧建媚

(廣州百花香料股份有限公司，廣州 510660)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、毛蟹、螃蟹、大閘蟹，是我國一項名貴的水產資源，也是主要的養殖經濟蟹類。其肉質細嫩， 味道鮮美，營養豐富[1，2]。隨著人工養殖蟹技術的發展和成熟，河蟹產量持續穩定增長。雖然蟹類產品加工歷史悠久，但是加工方式一般只有腌制(醉蟹)、干制(蟹肉松)、灌裝、速凍等[3]。并且河蟹在生產加工過程中，會產生蟹殼、蟹腿等大量廢棄物，導致產品利用率低，附加值下降。為了提高產品的技術含量和附加值，利用現代生物酶解技術深度酶解河蟹蛋白質，產生氨基酸、小分子多肽等，將其加工成蟹味調味料或者蟹味香精，既可以提高廢棄物的附加值，也可以解決污染和浪費問題。

熱反應型肉味香精具有香氣自然、醇厚逼真、成本低等優點，越來越受到食品廠商及消費者的喜愛，市場份額及發展空間也越來越大[4]。為了進一步研究蟹肉香精，本文以河蟹為原料，采用生物酶解技術制備蟹肉酶解液，再經過Maillard反應制備蟹肉風味香精。采用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質譜連用技術(HS-SPME-GC-MS)分別對河蟹酶提取物和Maillard蟹肉香精揮發性成分進行萃取和鑒定，旨在為蟹肉香精的開發提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

河蟹：市售；木瓜蛋白酶：華琪生物科技有限公司；風味蛋白酶：諾維信(中國)生物技術有限公司；葡萄糖、木糖：均為食品級；酵母抽提物(YE)；水解植物蛋白(HVP)；L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物、甘氨酸、精氨酸、維生素B1、牛磺酸：均為食品級。

1.2 實驗儀器

電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；絞肉機 廣州新域機電制造有限公司；TC-15恒溫電加熱套 鞏義市予華儀器有限責任公司；強力電動攪拌機 上海標本模型廠；三口燒瓶 江蘇華鷗玻璃有限公司；冷凝回流管 江蘇好奇教學儀器有限公司；7890B-5977B MSD氣相色譜-質譜聯用儀、HP-5MS UI色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) Agilent 科技有限公司；固相微萃取裝置(SPME) 美國Supelco公司。

1.3 蟹肉酶解液的制備

將河蟹用水清洗、切塊、絞碎，蟹肉與水的比例為3∶1，加入酶(木瓜蛋白酶的用量為0.35%，風味蛋白酶的用量為0.15%)進行酶解，酶解溫度60 ℃，酶解時間3 h，升溫至90 ℃以上滅酶，過60目篩網，得濾液。

1.4 Maillard蟹肉香精的制備

取80 g酶解液，加入6 g葡萄糖、1.5 g木糖、1 g L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物、2 g甘氨酸、0.5 g精氨酸、0.5 g牛磺酸、0.5 g維生素B1、38 g水、5 g酵母抽提物、5 g水解植物蛋白，加入反應釜中，102 ℃反應60 min，制得蟹肉香精。

1.5 頂空-固相微萃取(HS-SPME)條件

稱取酶解液/香精5 mL于萃取瓶中，加入磁力轉子，在磁力攪拌裝置中于55 ℃水浴加熱0.5 h。將已經老化好的帶75 μm CAR/PDMS涂層的萃取頭(250 ℃老化0.5 h)插入萃取瓶中。在樣品上方懸空，于55 ℃吸附1 h。靜止冷卻后于進樣口解吸3 min后進行GC-MS分析。

1.6 氣相色譜-質譜聯用分析(GC-MS) 條件

1.6.1 GC條件

用氦氣作載氣，流速為1 mL/min；分流比為120∶1；HP-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：色譜柱起始柱溫50 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至180 ℃，隨后以20 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；進樣口溫度250 ℃。

1.6.2 MS條件

電離方式為EI，離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度300 ℃；電子能量70 eV；掃描質量范圍29～550 amu；掃描方式為全掃描；調諧方式為自動調諧。

1.7 數據分析

1.7.1 定性分析

揮發性物質的鑒定結果根據W8N08譜庫檢索和自建香料庫。本研究中，將譜庫中化合物匹配度低于70(最大值為100)的組分標為未鑒定出。

1.7.2 定量分析

利用Excel數據處理軟件，扣除色譜圖中的苯乙腈等非嗅感雜峰，計算揮發性風味物質的總峰面積；每個樣品測定2次，求平均值，采用峰面積歸一化法確定各揮發性成分的相對含量。

1.8 氣味活度值的確定

采用氣味活度值法(odor activity value, OAV)評價各揮發性成分對蟹肉香精總體風味的貢獻，OAV=C/T(C為物質濃度或相對濃度，T為感覺閾值)。在一定范圍內，OAV值越大說明該物質對總體風味貢獻越大。

2 結果與分析

河蟹Maillard蟹肉香精的GC-MS分析圖譜見圖1。

圖1 河蟹酶解液Maillard香精揮發性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of river crab hydrolysate by Maillard reaction

保留時間(min)化合物感覺閾值[5](μg/kg)含量(%)OAV值11.7492-甲基吡嗪 2-methyl pyrazine 60～1050006.3828 0.1064 16.54462,5-二甲基吡嗪 2,5-Dimethyl pyrazine 800～180016.3628 0.0205

續 表

注：“-”表示無法檢測出該物質的感覺閾值。

由表1中的GC-MS鑒定結果可知，共有24種揮發性風味成分被檢測出，主要有醇類、醛類、酚類、硫醚類、雜環類(包括吡嗪、呋喃、噻唑、噻吩、吡咯)、其他等。單一組分中，含量最高的為苯甲醛(25.92%)、2,5-二甲基吡嗪(16.36%)、4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑(11.23%)、2,3,5-三甲基吡嗪(9.49%)、2-甲基吡嗪(6.38%)、2-乙酰基噻唑(4.48%)、苯乙醛(4.28%)、二甲基三硫醚(2.32%)等。

從OAV 值可以看出，對蟹肉香精香氣貢獻比較大的分別為：二甲基三硫醚(464.6)、β-紫羅蘭酮(57.51)、3-甲硫基丙醛(11.29)、苯乙醛(1.071)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(0.8053)、5-甲基-2-噻吩甲醛(0.6787)等。

醇類物質可能是脂肪酸的二級氫過氧化物的分解、脂質氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解或由羰基化合物的還原生成的[6]。由于自身高閾值的特點，醇類化合物對食品風味的貢獻較小，除非以高濃度存在或者是不飽和的。糠醇有特殊的苦辣香氣，苯甲醇則具有芳香氣味，文獻報道是對蟹香味有貢獻的化合物。

醛類、酮類主要是由多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解或者微生物氧化產生的，對香味的形成起到了修飾的作用[7，8]。醛類閾值通常比其他化合物低，具有青香、果香、堅果香和奶酪香等香氣。酮類貢獻于蟹等甲殼類水產品甜的花香和果香風味，并且具有較低的閾值。例如，苯甲醛具有苦杏仁、類似炒花生的香氣，3-甲硫基丙醛低濃度時具有肉湯、海鮮香氣。

雜環類化合物通常是Maillard反應的產物，包括呋喃、吡嗪、吡咯、噻唑、噻吩等。這些物質大多數以較低的濃度存在，多數具有肉香、烤肉香、焦香和堅果香等。呋喃類化合物通常是還原糖-氨基酸的相互作用、Amadori和Heyns中間體的降解、糖或硫胺素熱降解的產物，有似焦糖味、堅果味、肉味、水果味，具有增香的作用[9]。吡嗪類化合物一般具有烤香和堅果香，通過Maillard反應和Strecker熱降解生成，風味閾值較低[10]。例如，2,5-二甲基吡嗪會呈現較強的果仁香氣。噻吩類化合物主要是含硫氨基酸、或者含硫氨基酸與葡萄糖或木糖的熱降解產生的，是在Maillard反應的前期階段生成的，高溫是形成噻吩類物質的先決條件，噻吩類化合物風味特征比較明顯，對肉的總體風味具有基本的貢獻，如在蟹肉香精中鑒定出的5-甲基-2-噻吩甲醛。噻唑類物質一般是通過半胱氨酸的熱降解、或者含硫氨基酸與羰基化合物相互作用、或者硫胺素的熱降解產生的。一般氣味強烈，閾值低，如2-乙酰基噻唑具有堅果、谷物香和爆米花般的香氣。吲哚，又稱苯并吡咯，具有極強的揮發性，通常具有惡臭味、排泄物氣味。

硫醚通常來源于含硫化合物或不飽和脂肪酸，含硫化合物閾值較低，如二甲基三硫醚，通常影響食品的整體芳香。

3 結論

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用的方法，從蟹肉香精中共檢測出24種揮發性香氣成分，包括醇類、醛類、酚類、硫醚類、雜環類(包括吡嗪、呋喃、噻唑、噻吩、吡咯)、其他等，含量最高的分別為吡嗪類、醛類。單一組分中，含量最高的為苯甲醛(25.92%)、2,5-二甲基吡嗪(16.36%)、4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑(11.23%)、2,3,5-三甲基吡嗪(9.49%)、2-甲基吡嗪(6.38%)、2-乙酰基噻唑(4.48%)、苯乙醛(4.28%)、二甲基三硫醚(2.32%)等。

通過OAV值分析，結果表明對蟹肉香精香氣有突出貢獻的為：二甲基三硫醚(464.6)、β-紫羅蘭酮(57.51)、3-甲硫基丙醛(11.29)、苯乙醛(1.071)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(0.8053)、5-甲基-2-噻吩甲醛(0.6787)等。

通過河蟹酶解液Maillard反應制備的蟹肉香精，香氣醇厚，烤香濃郁，肉香自然，對其香氣成分進行分析和鑒定，可以了解其香氣組成，為蟹肉香精的開發提供了理論依據和基礎。