辣椒醬發(fā)酵過程中蛋白酶活性變化的研究

洪 玲

(新田縣市場監(jiān)督檢驗檢測中心，湖南 永州 425700)

辣椒自明朝時傳入中國后就開始在華夏的土地上廣泛種植，后成為菜品中必備的一種蔬菜，從古代一直流傳至今，而目前辣椒的種植已經遍布全世界，成為各國人民佐餐必不可少的一種重要原料。辣椒中含有辣椒堿，其包括多種不同結構的化學物質如辣椒素、降二氫辣椒堿等[1]，王夢等[2]將幾種辣椒素單同維生素E做對比，發(fā)現(xiàn)辣椒堿單位物質都具有明顯的抗氧化性，但這類物質雖會刺激口腔和皮膚讓人產生痛覺，但可以增進食欲，促進人體血液循環(huán)，更新細胞，使皮膚保持年輕狀態(tài)，改善寒涼體質。同時富含維生素，尤其是VC含量，平均約為180 mg/100 g以上[3]，紅辣椒中還含有辣椒紅色素[4]，這是一種混合物主要成分是葉黃素中的不同分子成分，可以作為食品的著色劑，顏色亮麗、無毒無害，還具有抗氧化的特性。

辣椒的加工目前應用最多的是初級加工，如制成干辣椒；既能長期儲存又能用于調味，諶智鑫等考察了不同儲藏環(huán)境對干辣椒品質的影響；制成油辣椒；貴州省知名品牌的老干媽就是將辣椒進行油炸后制成的調味品，張學君等發(fā)明了一種油辣椒的制作方法，具有香辣口感、保質期長和營養(yǎng)豐富等特點。而要想獲得高附加值的產品還要對辣椒進行深加工，比如提取辣椒堿、辣椒素，有研究學者發(fā)現(xiàn)經過稀釋的辣椒素具有美白皮膚的作用，可以制成化妝品使用[5-10]。而目前應用最廣泛的是將辣椒制成辣椒醬[11]， 用油脂煎炸辣椒，待五分熟后，加入黃豆醬制成簡單的家庭食用的熟醬，既具有典型的豆醬香味又有辣椒的味道和口感。而目前辣椒醬的制作已經發(fā)展到加入多種香辛料如生姜、大蒜、花椒甚至西紅柿等[12]，以及加入糖、食鹽、黃酒等，由微生物發(fā)酵制成調味品，相似的產品還有糟辣椒[13]，辣椒醬不僅營養(yǎng)豐富，通過微生物發(fā)酵的方式制成的風味發(fā)酵制品更具有市場前景。本實驗以辣椒醬工藝為研究對象，考察并分析了辣醬制作過程中蛋白酶活性值的變化趨勢，找出發(fā)酵型辣椒醬適宜的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。

1 實驗原理

1.1 酶活測定實驗原理

分光光度法是酶活力研究常用的方法，酶促反應中的底物常含有光譜紫區(qū)光學吸收的不飽和自由基。反應底物的濃度以在特定波長的吸收量來測量，而酶反應的進展則根據(jù)光吸收的變化來測量。本實驗主要利用該原理測定辣椒醬發(fā)酵過程中的蛋白酶活性，如梅源等通過測定不同菌種接種霉豆瓣后考察在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種以及蛋白酶活性，提高醬醪質量，確定最佳發(fā)酵菌種以及生產工藝[14]。

1.2 DGGE鑒定微生物群落原理

DGGE(變性梯度凝膠電泳)是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是一種可以確定發(fā)酵產品如酒醅、醋醅、醬醪基質發(fā)酵過程中微生物群落演替的一種分子標記方法。現(xiàn)已廣泛應用于生物多樣性調查、親緣關系鑒定、基因突變檢測等多個領域。DGGE/TGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細菌、藍細菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性[15，16]。

1.3 辣椒醬制作過程

挑選一定數(shù)量的大豆，除去可見的顆粒物，挑選飽滿、無腐爛和破損的顆粒。用清水沖洗，然后用清水浸泡，浸泡時間約為24 h，確保豆皮出現(xiàn)褶皺。將浸泡過的大豆濾出水分，放入蒸煮鍋中，直到幾乎變軟為止。根據(jù)配方要求蒸好的大豆將和蒸好的面粉混合后接入種曲，送入曲房。原料混合均勻，接種均勻，接種量0.3%，確保曲料疏松均勻地播撒，厚薄均勻。入曲后馬上進行翻曲，然后將面粉均勻地撒在紗布上，使其自然發(fā)酵，直到菌絲變成黃綠色。挑大小合適的辣椒，要求成熟、不腐爛。清洗，從中間切成兩半，用勺子把肉挖出來，切成約2 cm的小塊，放入托盤中供日后使用。最后，用天平稱重225 g的小辣椒、45 g的豆腐、10 g的生姜，并將適量的辣椒和八角混合。將混合好的原料放入罐中，在實驗要求的條件下發(fā)酵,實驗流程見圖1。

圖1 辣椒醬工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of chili sauce

2 材料與方法

2.1 實驗材料

丙烯酰胺/甲叉(37.5∶1)、尿素、100%去離子甲酰胺、50×TAE緩沖液、10 mg/mL溴化乙錠、2×膠上樣染料、過硫酸銨、TEMED：上海生工集團有限公司；酪蛋白：美國Sigma公司。

2.2 實驗方法

將0.3 g瓊脂糖溶解于30 mL的1×TAE緩沖溶液中，加熱溶解(微波爐加熱或沸水浴加熱，至瓊脂糖溶解)，稍微降溫后加入3 μL的核酸染料，混勻后倒入托盤中，插入梳子，約0.5 h后其冷卻。將凝膠放入電解槽中，加樣(加有l(wèi)oading buffer的DNA樣品)，在5 V/cm電壓下電泳30 min。在紫外光下觀察電泳條帶。

反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，65 ℃復性45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。將不同發(fā)酵過程的醬醪在容器不同部分取10份，使用DNA提取試劑盒進行提取，PCR產物全部進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下用無菌刀割下含目的DNA片段的瓊脂糖塊，稱重，放入1.5 mL的離心管中，用DNA純化通用試劑盒純化PCR產物，并用紫外分光光度計測定DNA濃度。反應體系見表1。

表1 25 mL PCR 反應體系Table 1 25 mL PCR reaction system

2.3 標準曲線的繪制

準確稱重1 g蛋白酶，用少量磷酸鹽緩沖液溶解后用玻璃棒研磨，然后將上液倒入100 mL的容量瓶中，再用玻璃棒在沉積物中加入少量緩沖，最后全部轉移到容量瓶中，稀釋到指定的比例，用4層紗布過濾。該酶已稀釋100倍，濾液可直接用作試驗酶。根據(jù)表2準備l-酪氨酸標準溶液。

表2 氨基酸標準溶液比率表Table 2 Standard solution ratio table of amino acid

2.4 樣品測定

取上述每個溶液1.00 mL，在每個溶液中加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL，不同濃度試劑溶液1.00 mL，放入(40±0.2) ℃恒溫水浴2 min，然后在波長680 nm用分光光度計測OD值，比色法去除，以無酪氨酸零管作為空白管，分別調整零點，測吸收度值，以吸收度值作為縱坐標，酪氨酸濃度作為橫坐標，繪制標準曲線或計算回歸方程。在OD為1時計算酪氨酸的量(μg)，即吸光度常數(shù)k值，其k值應在95～100之間。將2%的酪蛋白溶液置于(40±0.2) ℃的恒溫水浴中，預熱5 min；取4管，加入1 mL的酶解液,取1根作為空白管，加入2 mL的三氯乙酸溶液，在其他3個試管中各加入3 mL的酪蛋白溶液，搖勻，保持在40 ℃，持續(xù)10 min；取出試管，在3個試管中各加入2 mL的三氯乙酸溶液，在空白試管中加入1 mL的酪蛋白溶液，靜止10 min后，沉淀落到試管底部，從每個管中取出1 mL的濾液，分別加入5 mL的Na2CO3溶液和1 mL的福林試劑溶液。顏色是在40 ℃的恒溫水浴中培養(yǎng)20 min后形成的，OD值在680 nm波長下測量，用空管調整零點，使用Excel軟件繪制標準曲線，見圖2。

圖2 標準曲線圖Fig.2 Standard curve diagram

3 分析與討論

表3 短期內不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的蛋白酶活力變化值Table 3 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time in a short term

圖3 短期內辣椒醬發(fā)酵過程蛋白酶活力變化圖Fig.3 Change chart of protease activity in chili sauce fermentation in a short term

由表3和圖3可知，在辣椒醬制作過程中，在同一發(fā)酵日內，第1天在3種不同溫度下測得的豆腐的蛋白酶活性值不高，而第2天的蛋白酶活性含量變化的速率增加，第3天在3個溫度下測得的蛋白酶活性持續(xù)上升，達到了活動的峰值和最高值。其中蛋白酶活性值最高為35 ℃，其次為40 ℃，在室溫下蛋白酶活性值最低為30 ℃。第4天活動值下降，但變化不明顯。第5天開始急劇下降，蛋白酶活力最低。在相同的溫度條件下(30，35，40 ℃)，第1～3天，蛋白酶活力變化呈直線上升的趨勢，第3天達到高峰，這是蛋白酶的最高值。第4天呈下降趨勢，第5天的變化值趨于穩(wěn)定。

表4 長時間培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的蛋白酶活力變化值Table 4 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time under long-termculture condition

圖4 長時間培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的蛋白酶活力變化圖Fig.4 Change chart of protease activity at different culturetemperatures and culture time under long-termculture condition

由表4和圖4可知，在同一發(fā)酵日內，第1天在3種不同溫度下測得的辣椒醬醬醪中的蛋白酶活性值不大，并且在第5天蛋白酶活性值的變化率加速，在3個溫度下測得的蛋白酶活性值繼續(xù)呈線性上升，并在第20天達到峰值，活性值最高。其中蛋白酶活性值最高為40 ℃，其次為35 ℃，在室溫下蛋白酶活性值最低為30 ℃。在第25天，活動值下降，但變化不明顯。在第30天，活動值開始持平。在相同溫度條件下(30，35，40 ℃)，從第1～12天，基本上呈穩(wěn)定上升趨勢，在第20天達到最高值，蛋白酶活性值最高。25天的變化值略有下降，30天的變化值趨于持平。

不同發(fā)酵時間辣椒醬醪的DGGE圖譜見圖5。

圖5 不同發(fā)酵時間辣椒醬醪DGGE電泳圖Fig.5 DGGE electrophorograms of chili sauce mashat different fermentation time

圖5中A為前5 d辣椒醬醬醪中微生物群落分布，可以看出變化基本不大，微生物群落以及生物量基本一致。圖5中B為10～40 d發(fā)酵過程中微生物群落變化圖，其中第10天微生物構成最為豐富，15～30 d之間微生物群落變化較小，從第35天開始微生物群落變化很小。連同蛋白酶的變化數(shù)據(jù)可以看出，后期產蛋白酶的真菌逐漸被乳酸菌等多種不同種類細菌逐漸取代。周雯君等[17]通過測定醬油曲中的中性蛋白酶活性進行跟蹤，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)判定豆醬是否成熟以及在不同發(fā)酵階段的典型微生物群落構成。梁晉維等[18]通過單因素實驗考察了篩選得到的米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03產蛋白酶的最優(yōu)條件，因為豆醬起始必須有足夠的蛋白酶降解蛋白質才能得到高品質的成品醬。童佳[19]通過實驗測定了米曲霉產蛋白酶的規(guī)律支持了這種結果。樊君等[20]通過實驗測定圓盤制曲過程中蛋白酶活力值的最優(yōu)條件，以期能夠正確、有效地指導實際生產。朱永清等[21]使用DGGE技術分析了不同豆醬樣品中微生物真菌菌群結構,以期獲得高品質豆醬同微生物群落之間的關系。高秀芝等[22]使用DGGE方法測定了東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物群落的動態(tài)變化，確定了不同發(fā)酵時間微生物群落變化，其研究結果與本實驗研究結果相似。

4 討論

在不同的溫度條件和發(fā)酵天數(shù)下，測定了辣椒醬中蛋白酶在發(fā)酵過程中不同時間內的活性變化值。在辣椒醬制作過程中，蛋白酶的活性值在相同溫度條件下第3天最高，35 ℃的蛋白酶活性值在相同發(fā)酵日內最高。可見在制作辣椒醬的過程中，適宜的發(fā)酵溫度為35 ℃，適宜的發(fā)酵天數(shù)為3 d。在制作醬料的過程中，在同一溫度條件下，蛋白酶活性在第20天最高；在同一發(fā)酵日內，辣椒醬的蛋白酶活性最高；可見在制作辣椒醬的過程中，適宜的發(fā)酵溫度為40 ℃，適宜的發(fā)酵天數(shù)為20 d。