水豆豉中高產(chǎn)豆豉纖溶酶的菌株篩選、鑒定及生長性能研究

董科，陳宇航，沈丹蕓，裴曉方*

(1.四川大學 華西公共衛(wèi)生學院(華西第四醫(yī)院)，成都 610041；2.食品安全監(jiān)測與風險評估四川省重點實驗室，成都 610041)

豆豉纖溶酶(douchi fibrinolytic enzyme，DFE)是我國學者從傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中分離得到的一種絲氨酸蛋白酶。有研究表明，該酶是一種新型纖溶酶[1]，不僅具有半衰期長、纖溶活性高、安全無毒、口服效率高等優(yōu)點[2,3]，還可彌補目前臨床上治療血栓性疾病使用的溶栓劑如尿激酶和鏈激酶半衰期短、成本高、效率低等不足[4]。因此，通過各種微生物來源的纖溶酶治療血栓新型藥物的研究開發(fā)受到世界各國學者的重視。

1987年，日本學者發(fā)現(xiàn)了大豆發(fā)酵食品納豆中的納豆激酶具有高纖溶活性[5]，后續(xù)研究更揭示了納豆激酶具有降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗凝、神經(jīng)保護等作用[6]，且相關保健品已在市面上進行銷售；1996年，韓國學者[7]從本國傳統(tǒng)發(fā)酵食品Chung Kook-Jang中分離得到具有高活性的纖溶酶。而我國學者[8]也早在1999年就從豆豉中分離到了豆豉纖溶酶，并對其進行了大量的研究工作，包括產(chǎn)酶菌株的篩選、產(chǎn)酶基因克隆、豆豉纖溶酶的分離與純化及溶血栓機制的研究等[9]。但是，目前分離得到的豆豉纖溶酶酶活力低下和生產(chǎn)力水平不足制約著其進一步開發(fā)成為溶栓藥物。因此，通過豆豉纖溶酶高產(chǎn)菌株的篩選等方式提高酶活力及產(chǎn)量成為突破現(xiàn)有研究瓶頸的關鍵。

本研究以市售水豆豉為原材料，采用平板法初篩和化學法復篩相結(jié)合的方法，旨在篩選出1株活性較高的豆豉纖溶酶產(chǎn)酶菌株，為將水豆豉及相關發(fā)酵產(chǎn)品研發(fā)成具有溶栓作用的健康產(chǎn)品提供了備選菌株及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

在四川、云南和貴州省收集11種水豆豉樣品，收集后的樣品立即進行細菌分離培養(yǎng)，并將剩余樣品存于滅菌均質(zhì)袋中，-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基和LB肉湯培養(yǎng)基：均購于北京路橋技術有限責任公司；福林酚：購于北京索萊寶科技有限公司；酪蛋白：購于中國食品藥品檢定研究所；纖維蛋白原和凝血酶：購自Sigma公司；尿激酶：購自Aladdin公司；可溶性淀粉、無水碳酸鈉、L-酪氨酸、檸檬酸等其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設備

隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海飛躍實驗儀器有限公司；Multiskan GO酶標儀 賽默飛世爾科技公司；5430R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；HR40-Ⅱ A2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；分子成像儀、Power Pac BasicTM電泳儀、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR擴增儀 BIO-RAD公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株分離

將獲得的水豆豉樣品在無菌條件下各取3 g并加入營養(yǎng)肉湯，37 ℃、150 r/min搖床增菌培養(yǎng)24 h后，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，從平板中挑取形態(tài)、顏色不同(即可能為不同菌種)的菌落于斜面培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂)上保存，備用。

1.4.2 菌株產(chǎn)酶能力初篩

蛋白酶、淀粉酶初篩：將復蘇24 h后的菌株點種于酪蛋白培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上(淀粉酶初篩需要在菌落周圍滴加0.02 mol/L碘液)，觀察形成的透明圈，記錄透明圈直徑與菌落直徑，取透明圈直徑/菌落直徑進行比較。

豆豉纖溶酶初篩：接種菌株至肉湯，培養(yǎng)24 h，離心后吸取上清液8 μL滴加至纖維蛋白平板孔內(nèi)。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，16 h后測量垂直透明圈直徑。根據(jù)尿激酶標準曲線得到菌株于肉湯中所產(chǎn)的豆豉纖溶酶含量。

1.4.3 菌株產(chǎn)酶能力復篩

選取初篩后產(chǎn)酶能力較強的菌株，根據(jù)相關標準[10]中蛋白酶、淀粉酶的檢測方法及文獻[11]所述纖維蛋白酶解法進行復篩。

1.4.4 菌株常規(guī)鑒定

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)和《常用細菌鑒定手冊》(2001年)等所提及的方法對篩選出的高產(chǎn)纖溶酶菌株進行生理生化特性鑒定。

1.4.5 細菌gyrB基因測序鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

用直接水煮法提取細菌DNA，進行PCR擴增。細菌gyrB基因引物序列：UP2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′；UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAA

RTTYGA-3′， 擴增片段長度為1200 bp。擴增體系為(25 μL)：2×Mix(包含dNTP、Mg2+、Reaction Buffer、Polymerase)為12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)為1.0 μL，ddH2O為8.5 μL，DNA模板為2 μL。擴增條件：98 ℃預變性2 min；(98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s)35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定后送測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行核酸序列相似度比較，并使用Mega 6.0作系統(tǒng)進化樹，選取遺傳距離最近的種進行鑒定。

1.4.6 細菌生長性能測定

將已鑒定的菌株復蘇后每2 h吸取一定量菌液，用酶標儀在600 nm下檢測其OD值，至28 h結(jié)束，繪制菌株的生長曲線；另每2 h吸取一定量菌液離心后取其上清液，過0.22 μm濾膜后檢測豆豉纖溶酶含量，至28 h結(jié)束，繪制菌株的產(chǎn)酶曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酶能力的初篩

2.1.1 蛋白酶、淀粉酶初篩結(jié)果

從11份水豆豉樣品中分離出79株細菌(B01～B79)。以透明圈直徑/菌落直徑為考察蛋白酶(4 d)、淀粉酶(2 d)能力的指標。79株細菌的測定結(jié)果見表1，可見蛋白酶產(chǎn)酶率(98.7%)高于淀粉酶產(chǎn)酶率(83.5%)，且不同菌株產(chǎn)淀粉酶的能力較接近。其中，兩株細菌的產(chǎn)蛋白酶能力最高，其4 d透明圈直徑/菌落直徑為7(B29、B49)，僅有1株菌不產(chǎn)蛋白酶或產(chǎn)酶較少(B10)，無透明圈產(chǎn)生。

表1 細菌產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶能力初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of protease and amylase production ability of bacteria

酪蛋白平板的檢測圖見圖1中a，b，除圖1中b左下角的大腸桿菌標準株外，其余7株細菌均能產(chǎn)不同程度的蛋白酶。淀粉培養(yǎng)基的檢測圖見圖1中c,d，除圖1中c左邊兩株菌及圖1中d右上角菌株外，其余菌株均產(chǎn)淀粉酶。

圖1 平板法產(chǎn)酶能力初篩Fig.1 Preliminary screening of enzyme production ability by plate method

注：a,b為酪蛋白平板；c,d為淀粉培養(yǎng)基；e,f為纖維蛋白平板。

2.1.2 豆豉纖溶酶初篩結(jié)果

79株細菌產(chǎn)豆豉纖溶酶的測定結(jié)果見表2，產(chǎn)酶率為98.7%，不同菌株產(chǎn)酶能力差異較大。其中有29株細菌豆豉纖溶酶活性低于200 IU/mL，3株豆豉纖溶酶活性高于4000 IU/mL(B03、B61、B62)，活性最高的為6728 IU/mL(B03)，B10號菌株依然無透明圈產(chǎn)生。

表2 細菌產(chǎn)豆豉纖溶酶能力初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening results of douchi fibrinolytic enzyme production ability of bacteria

纖維蛋白平板的檢測圖見圖1中e,f。e為尿激酶標準溶液的溶解圈，f中除10號孔外，其余孔均有不同程度的豆豉纖溶酶產(chǎn)生。

2.2 菌株產(chǎn)酶能力的復篩結(jié)果

2.2.1 菌株選取

從初篩結(jié)果中選取同時滿足酪蛋白平板4 d透明圈與菌株直徑比≥3，淀粉培養(yǎng)基透明圈與菌株直徑比≥1，豆豉纖溶酶活力≥1000 IU/mL的菌株進行產(chǎn)酶能力的復篩。共有6株細菌滿足要求，分別是B02、B17、B37、B61、B62、B70。

2.2.2 菌株產(chǎn)酶能力復篩結(jié)果

菌株使用化學法復篩的結(jié)果見表3。除了B02與B37產(chǎn)堿性蛋白酶外，其余為中性蛋白酶?；钚宰罡叩那?個菌株分別為B02、B62、B61。產(chǎn)淀粉酶活性最高的菌株分別為B61、B17、B62。產(chǎn)豆豉纖溶酶能力最高的分別是B61、B70、B02。故綜合菌株3種產(chǎn)酶能力的情況，選擇B61號菌株進行斜面保存，并進行菌種鑒定。

表3 細菌產(chǎn)酶能力復篩Table 3 Rescreening of enzyme production ability of bacteria

注：由于菌株產(chǎn)淀粉酶含量過低，附錄中并不能查到相應的酶濃度，故在此以試驗孔與陰性對照孔的吸光度差值表示。差值越大，代表酶濃度越高。

2.3 B61菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學鑒定

B61接種營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落大小約為0.8 μm×1.2 μm，顏色呈乳白色不透明，形狀最初為圓形，繼而邊緣開始褶皺不整齊，挑開菌落后有粘液狀分泌物。顯微鏡下單個菌體呈桿狀，革蘭染色反應呈陽性，結(jié)果見圖2。

圖2 B61形態(tài)學鑒定Fig.2 Morphological identification of strain B61

注：a為菌落形態(tài)；b為顯微鏡下革蘭染色圖(×1000)。

2.3.2 菌株生化反應鑒定

將B61菌株與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌標準菌及貝萊斯芽孢桿菌對照，包括形態(tài)、生理、生化，結(jié)果見表4。同時根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》及文獻中生化反應項目[12,13], 通過溶血反應陽性可判斷其區(qū)別于枯草芽孢桿菌，符合解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌的生化特點。研究證明，貝萊斯芽孢桿菌作為解淀粉芽孢桿菌的同物異名菌，二者親緣關系較近(74%～89%)，暫無法區(qū)分。因此，B61菌株可初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌或貝萊斯芽孢桿菌。

表4 B61菌株的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain B61

2.3.3 gyrB基因測序結(jié)果

B61菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌或貝萊斯芽孢桿菌，選擇gyrB基因片段擴增測序，再度進行區(qū)分。將序列與Blast對比后選擇相似度高的參考菌株作系統(tǒng)進化樹，見圖3?？梢夿61與貝萊斯芽孢桿菌的親緣關系比較近，故鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

圖3 B61與參考菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B61 and reference strains

2.4 B61菌株生長曲線及產(chǎn)酶曲線

為了考察B61菌株的生長能力及產(chǎn)酶能力，繪制其生長曲線及產(chǎn)酶曲線，結(jié)果見圖4?？梢娋晟L2 h后便進入對數(shù)期，生長14 h后進入穩(wěn)定期，18 h后進入衰亡期。菌株生長6 h后可檢測到豆豉纖溶酶活性，生長到16 h時酶活性達到最高，為826.25 IU/mL，繼而穩(wěn)定至20 h，然后緩慢下降。產(chǎn)酶曲線與生長曲線具有一定的同步性。

圖4 B61的生長曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.4 Growth curve and enzyme production curve of strain B61

3 討論

本研究以收集云、貴、川地區(qū)水豆豉為原材料，利用不同培養(yǎng)基對分離菌株進行產(chǎn)酶能力的初步篩選，平板法發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、豆豉纖溶酶的比例分別為98.7%、83.5%、98.7%。再從中選擇產(chǎn)酶能力較強的6株菌進行化學法復篩，得到產(chǎn)酶能力最強的菌株B61，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌是Ruiz-Garcia等[15]于2005年新命名的芽孢桿菌種，隨后被Wang等[16]確定為解淀粉芽孢桿菌的后期異型體。所以貝萊斯芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的親緣性較近，但目前未見能將二者分開的生化反應標準，第八版的伯杰細菌手冊中，也未見具體描述貝萊斯芽孢桿菌的生化反應。Fan B等[17]于2007年提出貝萊斯芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌在ANI和dDDH上的區(qū)別是在區(qū)分物種的界值以下的，所以建議都納入解淀粉芽孢桿菌組。因此，在GenBank中，貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌也均屬于Bacillusamyloliquefaciens。Hee C B等[18]對解淀粉芽孢桿菌組的3個菌種基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌富含次生代謝產(chǎn)物合成的相關基因，也有更多參與抑菌化合物合成的基因。

目前關于貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)豆豉纖溶酶能力的相關發(fā)現(xiàn)較少，僅查看2019年Yao Z等[19]從傳統(tǒng)海鮮發(fā)酵物中分離到1株產(chǎn)豆豉纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌。在本研究中，該貝萊斯芽孢桿菌的生長曲線2～14 h為對數(shù)生長期。不同文獻中同一種菌的生長曲線略有差異，吳擁軍等[20]報道枯草芽孢桿菌的對數(shù)生長期為5～10 h，解淀粉芽孢桿菌為2～16 h，與貝萊斯芽孢桿菌接近。張旭等報道解淀粉芽孢桿菌的豆豉纖溶酶活性在2 h即能檢測出，在24 h達到最大值，而本研究中，6 h可檢測到豆豉纖溶酶活性，16 h達到最大活性，造成差異的可能原因是該文獻采用的化學法，檢出限相對于平板法較低。

4 結(jié)論

本研究采用平板法初篩和化學法復篩相結(jié)合的方法，從四川、云南和貴州收集的11種市售水豆豉樣品中篩選出1株高產(chǎn)纖溶酶菌株B61，經(jīng)過一系列生理生化特征分析，并結(jié)合gyrB基因測序分析，鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌，且該菌株在16 h后檢測到最高豆豉纖溶酶活力，為826.25 IU/mL。

綜上所述，B61菌株無論作為纖溶酶生產(chǎn)菌還是水豆豉發(fā)酵菌株，均具有優(yōu)良性能，也為進一步開發(fā)成為溶血栓藥物提供了生物菌株和數(shù)據(jù)參考。