泡菜發酵中不同蒜濃度、pH和鹽度組合對大腸桿菌生長影響的模擬研究

閆鳴霄，吳正云，司育雷，全江龍，張文學

(四川大學 輕紡與食品學院 食品工程系，成都 610065)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，添加適量鹽，經自然發酵或添加外源發酵劑發酵的蔬菜制品。泡菜制作中，原料和操作環境可能帶來包括食源性致病菌在內的各種微生物污染[1,2]。大蒜是泡菜制作中的常用輔料，除增加風味、改善口感等作用外，還能抑制大腸桿菌等常見食源性致病菌的生長[3]。泡菜發酵是一個動態過程，pH等指標隨發酵的進行而改變，此外，發酵鹽度和溫度在不同的操作中也有較大差異，這些因素都可能對控制泡菜中大腸桿菌的生長產生影響。目前對泡菜中大腸桿菌的研究多集中在篩選抑制大腸桿菌的菌株等方面[4,5]，對影響其生長的環境因素探討不多。本研究參考泡菜發酵過程，通過模擬試驗探究大蒜、鹽度、pH、溫度等因素對大腸桿菌生長的影響規律。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌Escherichiacoli(CICC 10305)。

參考郭永剛等的方法[6]，采用LB培養基進行菌株活化與菌懸液制備。

1.2 大蒜提取液制備

新鮮大蒜：購于成都市郭家橋綜合農貿市場。將10 g大蒜搗碎后于50 mL 80%乙醇溶液中萃取24 h，超聲30 min后抽濾，在8000 r/min下離心10 min，取上清液于轉速10 r/min、溫度50 ℃下旋蒸濃縮，得到蒜提取液10 mL(濃度1 g/mL)[7]。

1.3 不同大蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合條件下的大腸桿菌抑制試驗

選用蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)、pH(4，4.5，5，5.5，6，6.5)、鹽度(1%、2%、3%、4%、5%、6%)和溫度(20，28，37 ℃)4個因素進行均勻試驗設計(見表1)，以LB培養基為基礎培養基，按照均勻設計表調整各組培養基以探究大蒜濃度、鹽度、pH、溫度對大腸桿菌生長的影響。鹽度通過外加氯化鈉、pH用乳酸和氫氧化鈉溶液調節。培養基經121 ℃、20 min滅菌，冷卻后加入蒜提取液。各試驗組于對應溫度培養72 h，每隔6 h測定OD600值[8]，以LB培養基為對照，每個試驗組做3次平行，取平均值作為測定結果。

表1 均勻試驗設計U12(12×62×3)Table 1 Uniform experimental design U12(12×62×3)

1.4 低鹽條件下不同pH和大蒜濃度組合的大腸桿菌抑制試驗

確定各試驗組均為鹽度2%、溫度28 ℃，對pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)進行組合(共50種組合)。以模擬常見發酵溫度下低鹽泡菜的發酵環境，探究低鹽下大蒜濃度和pH對大腸桿菌生長的影響規律，具體操作同1.3。

1.5 數據處理

采用Logistic模型擬合大腸桿菌生長[9]，并考慮生長延遲期：

當t

(1)

式中：X為大腸桿菌的OD600值；X0為t=0時對應的OD600值；Xmax為最大生物量對應的OD600值；t為生長時間，h；td為延遲期，h；μmax為最大比生長速率，h-1。

采用逐步回歸分析蒜濃度、鹽度、pH、溫度對大腸桿菌生長的影響規律。

采用Matlab V7.1軟件進行試驗數據擬合；采用SAS V6.12軟件進行逐步回歸分析。

2 結果與討論

2.1 不同大蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合對大腸桿菌的影響

在不同蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合條件下，大腸桿菌的生長趨勢明顯不同，見圖1。

圖1 不同蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合對大腸桿菌生長的影響Fig.1 The effect of different combinations of garlic concentration, salinity, pH and temperature on the growth of E. coli

由圖1可知，在72 h后，7號延遲期長于對照組，但在第2天時表現出明顯的對數增長趨勢。此外，9號在54 h出現增長趨勢，提示大腸桿菌生長未被完全抑制。其余各組對大腸桿菌生長有明顯的抑制作用，生長量比對照組減少了94%以上。為探討大蒜濃度、pH、鹽度和溫度等因素對大腸桿菌的影響規律，以4個因素為自變量，大腸桿菌生長量、生長延遲期和最大比生長速率分別為因變量，進行逐步回歸分析，得到如下方程：

Xmax=-0.36-0.13S鹽度+0.19pH，R2=0.516。

(2)

td=88.16+0.46G蒜濃度pH-1.47pH2，R2=0.614。

(3)

式中：Xmax為最大生物量對應的OD600值；td為延遲期，h；S鹽度為鹽度，%；G蒜濃度為大蒜濃度，%。

根據以上方程，大腸桿菌生長量受鹽度和pH影響較大。在所研究的范圍內，鹽度越高，pH越低，則大腸桿菌生長量越低，符合楊振泉等[10]、廖春麗等[11]關于鹽度、pH影響大腸桿菌生長結果的報道。大腸桿菌生長延遲期受蒜濃度和pH影響較大。較高的pH下，大蒜濃度對大腸桿菌的抑制作用更明顯，提示pH可能是影響大蒜抑制大腸桿菌生長的主要因素，這可能與蒜的有效抑菌成分大蒜素在pH為 6.5時具有最強抑菌活性有關[12]。pH的二次方項表明pH與延遲期存在非線性關系，當pH處于某適中區間時，大腸桿菌延遲期達到極值，而該pH區間范圍則與蒜濃度有密切的關系，在考察范圍內，pH越低，蒜濃度越高，大腸桿菌延遲期越長。對大腸桿菌最大比生長速率的逐步回歸分析未得到有意義方程(詳細結果略)。分析R2值較低的原因在于自變量數較多，取值范圍較大，逐步分析所得變量之間關系較為復雜。

2.2 低鹽條件下不同pH和大蒜濃度組合對大腸桿菌的影響

由回歸方程(2)、(3)可知，在所考察范圍內，溫度對大腸桿菌的生長影響不大；當鹽度較低時，大腸桿菌將出現更大幅度的生長。鑒于泡菜低鹽度發酵的發展趨勢[13]，對2%鹽濃度下不同pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)組合對大腸桿菌生長的影響進行了測試，并采用方程(1)對大腸桿菌的生長曲線進行擬合獲得參數(詳細結果略)。以pH、蒜濃度為自變量，大腸桿菌生長量、生長延遲期和最大比生長速率分別為因變量，進行逐步回歸分析，得到如下方程：

Xmax=2.68+0.64pH-0.01G蒜濃度pH，R2=0.679。

(4)

td=193.54-30.45pH+1.19G蒜濃度pH-0.40G蒜濃度2，

R2=0.715。

(5)

μmax=0.30+0.07pH，R2=0.689。

(6)

式中：μmax為最大比生長速率，h-1。

根據以上方程，2%鹽度下，pH越低，大腸桿菌生長量越低；生長量還受蒜濃度和pH的交互作用影響，較高的pH下，大蒜濃度對大腸桿菌的抑制作用更明顯。由圖2可知，大腸桿菌生長延遲期受pH和蒜濃度的影響較大，pH降低能延長大腸桿菌延遲期；蒜濃度的二次方項表示蒜濃度與延遲期存在非線性關系，在考察范圍內，蒜濃度越高，pH越低，大腸桿菌延遲期越長；蒜濃度與pH的交互作用說明：相較低pH，高pH下蒜濃度對大腸桿菌生長量影響更大；相較高濃度蒜，低蒜濃度下pH對大腸桿菌生長量影響更大。此外，pH越低，大腸桿菌最大比生長速率越低。

圖2 低鹽下蒜濃度和pH對大腸桿菌的生長延遲期的影響Fig.2 The effect of garlic concentration and pH on the delay period of E. coli under low-salt condition

結合擬合結果可知，在pH為5～6.5和低濃度蒜組合條件下，大腸桿菌的延遲期明顯短于對照組，提示低濃度的蒜可能對大腸桿菌生長有一定的促進作用，并且該作用與pH范圍有關。以大蒜濃度(0%～3%)和pH為自變量，大腸桿菌生長延遲期為因變量，進行逐步回歸分析，得到如下方程：

td=745.56-237.64pH-15.84G蒜濃度+19.29pH2+7.20G蒜濃度2，R2=0.8067。

(7)

圖3 低鹽下低蒜濃度對大腸桿菌生長延遲期的影響(pH 6)Fig.3 The effect of low-garlic concentration on the delay period of E. coli under low-salt condition (pH 6)

結果顯示：在考察范圍內，大腸桿菌生長延遲期與pH和蒜濃度有關，且二者與大腸桿菌生長延遲期均為非線性關系且不存在交互作用。根據方程計算，當pH為6～6.5、蒜濃度為1%左右時，大腸桿菌生長延遲期最短，提示低濃度的蒜對大腸桿菌生長具有一定的促進作用。當pH 為6、蒜濃度為0%～2.1%時，大腸桿菌生長延遲期明顯短于對照組(見圖3)。類似的情況在甘草、黃芪等[14,15]天然藥材中也有報道。

結合泡菜發酵的環境因素考慮，在泡菜發酵，尤其是低鹽泡菜發酵中，蒜濃度至少應大于2%才能發揮抑菌作用。由于泡菜發酵微生物種類和環境因素復雜，大腸桿菌的生長情況受到了多方面因素的綜合影響。本研究所選因素有限，分析結果的精確性受到一定限制，但仍可為進一步研究提供參考。

3 結論

通過模擬試驗考察了泡菜發酵中大蒜濃度、鹽度、pH和溫度等因素對大腸桿菌生長的綜合影響。結果顯示：pH和蒜濃度是影響大腸桿菌生長最主要的因素，其次是鹽度；高鹽低pH下大腸桿菌生長幅度較小；較低pH和較高蒜濃度下大腸桿菌生長延遲期較長。低鹽濃度(2%)條件下，pH和蒜濃度仍是決定大腸桿菌生長延遲期的主要因素，相較低pH，高pH下蒜濃度對大腸桿菌生長量影響更大；相較高濃度蒜，低蒜濃度下pH對大腸桿菌生長量影響更大；最大比生長速率則主要受pH影響。低鹽(2%)低蒜濃度(0%～4%)下，pH和蒜濃度對大腸桿菌的延遲期呈現更為復雜的影響，pH 6～6.5和蒜濃度1%時大腸桿菌生長延遲期最短。