枯草芽孢桿菌MX-6的特性研究

滿麗莉,向殿軍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性非致病菌，具有較強(qiáng)的抗逆特性，能夠耐受人體、生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過(guò)程中遇到的各種環(huán)境。美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部分別在1989年和1999年批準(zhǔn)枯草芽孢桿菌的使用，其具有改善腸道環(huán)境、提高免疫力和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等作用，在食品發(fā)酵、微生態(tài)制劑、口服藥物、疫苗載體、污水處理等方面被廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[1]。

國(guó)內(nèi)外的益生菌制劑主要是人及動(dòng)物腸道內(nèi)的正常微生物菌群，益生菌制劑的品質(zhì)及特征直接影響終產(chǎn)品的效果與質(zhì)量。枯草芽孢桿菌作為一種益生菌，要從制劑生產(chǎn)到進(jìn)入人體和動(dòng)物胃腸道中發(fā)揮作用，需經(jīng)受高溫、胃酸、膽汁、腸道菌群等多種因素的影響，因此確定枯草芽孢桿菌的耐受性和抑菌特性，有利于分析其工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和有效性[2]。本研究綜合分析了從中國(guó)豆豉中分離出的一株納豆激酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)曲線、耐熱性、對(duì)不同pH的人工胃液的耐受性、對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性、抑菌特性及藥物敏感性，旨在為更合理地應(yīng)用和挖掘枯草芽孢桿菌提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌MX-6(BacillussubtilisMX-6):從中國(guó)豆豉中篩選鑒定獲得。

指示菌菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；霉菌及乳酸菌為本實(shí)驗(yàn)室自行分離保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CT型超凈工作臺(tái) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋 北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；Microfuge 16型離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 德國(guó)Wiggens公司；DHP-600恒溫培養(yǎng)箱 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺 東莞市景有模具五金有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌MX-6的活化及種子液的制備

菌種的活化：挑取枯草芽孢桿菌MX-6接種于裝有50 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)14 h，將OD600調(diào)至1.5～1.6。

種子液的制備：將活化的菌液按5%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)14 h，將OD600調(diào)至1.5～1.6。

1.2.2 枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化后的枯草芽孢桿菌MX-6按5%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)36 h，每隔2 h測(cè)定OD600值。

1.2.3 枯草芽孢桿菌MX-6的溫度耐受性測(cè)定

將1 mL種子液分別置于60，70，80，90，100 ℃下水浴30 min，流水冷卻。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，運(yùn)用平板菌落計(jì)數(shù)法分析枯草芽孢桿菌MX-6的溫度耐受性。存活率(%)=(處理后的活菌數(shù)/處理前的活菌數(shù))×100。

1.2.4 枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)人工胃液的耐受性測(cè)定

人工胃液的制備：取10 g胃蛋白酶，2 g NaCl，7 mL濃鹽酸，加蒸餾水至約800 mL，搖勻、定容至1000 mL。用HCl分別將100 mL人工胃液的pH調(diào)至1.0～4.0，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。種子液按5%接種于不同pH的人工胃液中，處理1～4 h。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，運(yùn)用平板菌落計(jì)數(shù)法分析菌株對(duì)人工胃液的耐受性。存活率(%)=(處理后的活菌數(shù)/處理前的活菌數(shù))×100。

1.2.5 枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)人工腸液的耐受性測(cè)定

人工腸液的制備：500 mL蒸餾水溶解6.8 g KH2PO4，調(diào)pH至6.8，加入10 g胰蛋白酶，定容至1000 mL。100 mL人工腸液中分別加入0.1～0.4 g膽鹽(終濃度為0.1%～0.4%)，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。種子液按5%接種于含有不同濃度膽鹽的人工腸液中，處理1～4 h。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，運(yùn)用平板菌落計(jì)數(shù)法分析菌株對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性。存活率(%)=(處理后的活菌數(shù)/處理前的活菌數(shù))×100。

1.2.6 枯草芽孢桿菌MX-6的抑菌特性

發(fā)酵上清液的制備：種子液按5%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)30 h，5000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

抑菌活性的測(cè)定：指示菌菌液(105CFU/mL)按1%加入約50 ℃的固體培養(yǎng)基中，搖勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻后打孔(孔徑為6 mm)，在孔中加入100 μL上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.7 枯草芽孢桿菌MX-6的藥敏試驗(yàn)

枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)20種抗菌藥物的敏感性應(yīng)用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中的One-way Analysis of Variance(ANOVA)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)曲線

圖1 枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis MX-6

由圖1可知，枯草芽孢桿菌MX-6在0～2 h生長(zhǎng)速度較慢，處于延滯期；2～14 h菌株的生長(zhǎng)速度劇增，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；14 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，其OD600為1.929；16～28 h菌株的生長(zhǎng)量基本保持不變(P>0.05)，為穩(wěn)定期；28 h以后菌株的生長(zhǎng)量顯著下降(P<0.01)，表明枯草芽孢桿菌MX-6已經(jīng)進(jìn)入衰亡期。枯草芽孢桿菌MX-6的延滯期較短，達(dá)到最大生長(zhǎng)量所需的時(shí)間較短，且菌株生長(zhǎng)量大、活力強(qiáng)，有助于縮短發(fā)酵時(shí)間、提高設(shè)備使用率、降低生產(chǎn)成本，為其工業(yè)化應(yīng)用提供了必要的條件。本研究與姚勇芳等、楊鋒等的研究結(jié)果不同，可能是由于菌株差異、種子培養(yǎng)基不同、培養(yǎng)條件不同所造成的[3,4]。

2.2 溫度耐受能力

圖2 不同熱處理對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6存活率的影響Fig.2 Effect of different heat treatments on the survival rates of Bacillus subtilis MX-6

由圖2可知，隨著處理溫度的上升，枯草芽孢桿菌MX-6的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在60～100 ℃處理30 min存活率均大于52.91%，說(shuō)明菌株的溫度耐受性較高。在60 ℃和70 ℃處理30 min存活率能達(dá)到90%以上，顯著高于80,90,100 ℃處理30 min的存活率(P<0.01)，其耐熱性優(yōu)于巴翠玉等從養(yǎng)魚塘底泥和健康鯽魚中，汪海峰等從仔豬腸道中，溫燦權(quán)等從健康豬腸道內(nèi)容物、新鮮糞便及豬場(chǎng)周邊土壤中分離的枯草芽孢桿菌。掌握枯草芽孢桿菌MX-6的溫度耐受性關(guān)系到菌種進(jìn)入人體后的活性及食品加工過(guò)程中的穩(wěn)定性，該菌株在100 ℃處理30 min仍具有較好的熱穩(wěn)定性，滿足開(kāi)發(fā)為益生菌制劑的前提條件之一[5-7]。

2.3 對(duì)人工胃液的耐受能力

胃是人及動(dòng)物清除進(jìn)入人及動(dòng)物體內(nèi)病原菌的保護(hù)屏障，作為益生菌制劑的前提條件之一是在胃液中能夠存活。人體及動(dòng)物胃液的pH一般為1～2，食物在胃中的排空時(shí)間一般為4 h，因此，本試驗(yàn)是研究枯草芽孢桿菌MX-6在pH 1～4的人工胃液中處理1～4 h的耐受性[8-10]。

圖3 不同pH的人工胃液對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6存活率的影響

由圖3可知，在同一pH條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌MX-6的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而在同一處理時(shí)間內(nèi)，隨著pH的增加，存活率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。pH為1條件下的存活率顯著低于pH為2～4條件下的存活率(P<0.01)。不同pH(1～4)的人工胃液、不同處理時(shí)間(1～4 h)條件下的存活率均達(dá)到71.87%以上，說(shuō)明枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)胃液的耐受性較強(qiáng)。相關(guān)研究顯示枯草芽孢桿菌對(duì)胃液的耐受性不同，有的甚至沒(méi)有胃液耐受性，可能是由于菌株的分離來(lái)源、培養(yǎng)條件、孢子狀態(tài)的差異所造成的[11,12]。

2.4 對(duì)人工腸液的耐受能力

腸液是人及動(dòng)物清除進(jìn)入體內(nèi)病原菌的另一道保護(hù)屏障，在腸液中能夠存活，并保持足夠的活性是作為益生菌發(fā)揮作用的另一必要條件，因此作為益生菌制劑必須對(duì)腸液及膽鹽具有較高的耐受性，腸液pH值一般約為7.6(堿性)，且正常小腸中的膽鹽含量一般為0.03%～0.3%，食物在小腸中的停留時(shí)間通常為1～4 h。因此，本試驗(yàn)是研究枯草芽孢桿菌MX-6在膽鹽濃度為0～0.4%的人工腸液中處理1～4 h的耐受性[13]。

圖4 不同膽鹽濃度的人工腸液對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6存活率的影響Fig.4 Effect of artificial intestinal fluid with different concentration of bile salt on the survival rates of Bacillus subtilis MX-6

由圖4可知，人工腸液和膽鹽對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6的存活率均有一定的影響。1～4 h時(shí)枯草芽孢桿菌MX-6在人工腸液對(duì)照組的存活率在，均顯著高于不同膽鹽濃度人工腸液組的存活率(P<0.01)。而在0.1%～0.4%膽鹽濃度的人工腸液中，隨著膽鹽濃度的升高，枯草芽孢桿菌MX-6的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各組間存活率差異不顯著(P>0.05)。不同濃度膽鹽(0.1%～0.4%)的人工腸液、不同處理時(shí)間(1～4 h)條件下的存活率均達(dá)到74.13%以上，說(shuō)明枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性較強(qiáng)。與其他研究結(jié)果不同可能是由于菌株差異、前處理差異等原因所造成的[14,15]。

2.5 枯草芽孢桿菌MX-6的抑菌能力

圖5 枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)青霉(a)、金黃色葡萄球菌(b)和大腸桿菌(c)的抑菌圈Fig.5 Bacteriostatic circles of Bacillus subtilis MX-6 against Penicillium(a), Staphylococcus aureus(b) and Escherichia coli(c)

由圖5可知，枯草芽孢桿菌MX-6的發(fā)酵液對(duì)青霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑分別達(dá)到(11.38±0.24) mm、(17.86±0.19) mm和(18.02±0.45) mm，而對(duì)乳酸菌(發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌、格氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、口乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌)無(wú)抑制作用，而且發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌MX-6的發(fā)酵液有助于促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)。與其他研究結(jié)果不同可能是由于菌株來(lái)源、分泌的抑菌物質(zhì)種類、發(fā)酵條件、代謝機(jī)制不同等所造成的。

枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)食品中3種常見(jiàn)的腐敗菌及致病菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，有利于延長(zhǎng)食品的貨架期、提高食品的安全性。枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)乳酸菌沒(méi)有抑制作用，作為益生菌制劑進(jìn)入人體后不會(huì)破壞胃腸道的菌群平衡，且能促進(jìn)腸道益生菌——乳酸菌的增殖，乳酸菌是人體胃腸道、泌尿生殖道中的正常菌群，可生成過(guò)氧化氫、有機(jī)酸、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，并通過(guò)腸黏膜黏附位點(diǎn)或競(jìng)爭(zhēng)資源抑制腐敗菌和致病菌，有助于提高胃腸道免疫功能和維持胃腸道菌群平衡[16]。

2.6 對(duì)抗菌藥物的敏感性

由于耐藥基因存在于質(zhì)粒上，易于出現(xiàn)水平漂移，造成耐藥性水平擴(kuò)散，耐藥性是判斷菌株是否可成為益生菌制劑的關(guān)鍵條件之一。枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)呋喃妥因?yàn)橹忻簦瑢?duì)其余的19種抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感(見(jiàn)表1)，不會(huì)導(dǎo)致人體腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境耐藥基因的水平傳播。與劉鑫等、李晶晶等的研究結(jié)果不同可能是由于菌株差異所造成的[17,18]。

表1 枯草芽孢桿菌MX-6對(duì)18種抗菌藥物的敏感性Table 1 Sensitivity of Bacillus subtilis MX-6 to 18 kinds of antimicrobial agents mm

注: 抑菌圈直徑<10 mm為耐藥，10～20 mm為低敏，≥20～30 mm為中敏，≥30 mm為敏感。

3 結(jié)論

益生菌制劑不但有助于提高食品工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且具有安全性高、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，有利于維持生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)和環(huán)境保護(hù)的可持續(xù)發(fā)展，作為常用的益生菌——枯草芽孢桿菌能形成內(nèi)生芽孢，具有較強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力，能抑制腸道致病菌和提高胃腸道免疫力[19]。本研究從中國(guó)豆豉中分離到的一株納豆激酶高產(chǎn)菌——枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)曲線和在不良環(huán)境下的體外耐受性，對(duì)菌株的益生潛能給予評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵速度快，發(fā)酵能力強(qiáng)，在14 h即可達(dá)到最大生長(zhǎng)量。對(duì)熱、胃液、腸液和膽鹽具有較強(qiáng)的耐受性，對(duì)常見(jiàn)的腐敗菌和致病菌具有抑制作用，對(duì)乳酸菌無(wú)抑制作用，無(wú)耐藥性，其在生產(chǎn)加工和人體胃腸道中具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。