轉(zhuǎn)染試劑Vigofect對HeLa細胞轉(zhuǎn)染的方案優(yōu)化

李思琦 李春雅 翁夢露 楊 悅 張健翔 劉 進 商 瑜 張曉嫣

（北京師范大學生命科學學院 北京 100875）

0 前言

“轉(zhuǎn)染試劑Vigofect 對 HeLa 細胞轉(zhuǎn)染的方案優(yōu)化”是為生物學一年級研究生開設的細胞及組織培養(yǎng)課程中，學生做的開放實驗課題。在學習了轉(zhuǎn)染技術(shù)基本原理與操作、熒光顯微鏡成像技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)后，學生綜合運用以上技術(shù)，使用轉(zhuǎn)染試劑，對HeLa 細胞的轉(zhuǎn)染條件進行研究，分析影響轉(zhuǎn)染效率的因素，探究轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化方案，以便為自己今后的實驗工作提供借鑒。同時，這種問題導向性實驗的設置，是為培養(yǎng)學生的創(chuàng)新性思維，改進研究生教學工作進行的探索。

轉(zhuǎn)染是采用除病毒感染外的其他方法將外源核酸（DNA 或者 RNA）人工導入真核細胞的過程。通過轉(zhuǎn)染能改變細胞內(nèi)蛋白表達，改變細胞特性，是研究基因或其產(chǎn)物功能和調(diào)控機制的一種非常重要的技術(shù)手段［1］。將外源基因?qū)胝婧思毎姆椒ㄓ泻芏喾N，例如：DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、顯微注射法及電穿孔法等［2］。

目前常用的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，它們?nèi)菀淄高^細胞膜，其中陽離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率。但由于陽離子脂質(zhì)體易被血清清除，有高水平毒性，因此陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑被日益廣泛地研發(fā)與使用。陽離子非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑以陽離子聚合物為主要成分，其高度的分支結(jié)構(gòu)確保了正離子電荷的高密度，使與帶有負電荷的外源基因結(jié)合更有效，容易被細胞吸收，適合多種類型的細胞系，可廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染［3］。Vigofect 采用陽離子非脂性物質(zhì)為主的配方，是一種高效真核轉(zhuǎn)染試劑，可與 DNA 形成穩(wěn)定的復合物，透過細胞膜進入細胞內(nèi)，并保護 DNA 免受核酸酶的降解。

HeLa 細胞是現(xiàn)代生命科學研究中經(jīng)常使用的一種細胞，是種源自一位美國婦女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宮頸癌細胞的細胞系。HeLa 細胞是生物學研究中非常重要的實驗材料，該細胞形態(tài)規(guī)則，生長速度較快，易于培養(yǎng)，且較易攝入外源質(zhì)粒 DNA，是檢測轉(zhuǎn)染試劑效果的合宜材料。

轉(zhuǎn)染過程中影響轉(zhuǎn)染效率的因素包括：細胞狀態(tài)、細胞密度、DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例、轉(zhuǎn)染前細胞培養(yǎng)時間、轉(zhuǎn)染試劑孵育時間、培養(yǎng)液體積等。實驗室將長期使用Vigofect 對Hela 細胞進行細胞轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染流程沿用原有方法，未做過轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，希望通過此次實驗，能在質(zhì)粒使用跟細胞轉(zhuǎn)染時間上進行優(yōu)化，既得到最大轉(zhuǎn)染效率，又能節(jié)省試劑，更合理地安排實驗時間。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 人子宮頸癌細胞（HeLa，由北京師范大學生命科學學院商瑜實驗室提供）、GFP 質(zhì)粒、CHIP 過表達質(zhì)粒（HA-CHIP）。

150 mmol／L NaCl（超純水配制，高壓或過濾滅菌）、Vigofect 轉(zhuǎn)染試劑（威格拉斯）、牛奶（伊利脫脂奶粉配制）、Anti-CHIP（本實驗室保存）、Anti-βactin（Sigma）、山羊抗小鼠 lgG／辣根酶標記（中杉金橋）、山羊抗兔 lgG／辣根酶標記（中杉金橋）、曝光試劑盒（顯色底物，Thermo Scientific）、DMEM basic（gibco）、PBS（gibco）、胎牛血清 FBS（康源生物）。

1.2 實驗儀器（表1）

表1 實驗儀器及來源

1.3 實驗步驟

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將HeLa 細胞培養(yǎng)在含 10%胎牛血清的 DMEM 中（按 1∶1000 加入雙抗），37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率分析 轉(zhuǎn)染前一天鋪細胞于12 孔板，使細胞在轉(zhuǎn)染當天達到指定匯合度（本實驗中涉及匯合度為40%～100%）。

轉(zhuǎn)染試劑為威格拉斯公司的Vigofect，根據(jù)該公司提供的產(chǎn)品說明步驟進行轉(zhuǎn)染。

配制 Vigofect 工作液，1 μL Vigofect 加入 49 μL 150 mmol/L NaCl 溶液中。輕輕混勻，靜置 5 min。工作體積每孔50 μL。

配制 DNA 工作液，工作體積為每孔50 μL。

將Vigofect 工作液分別逐滴加入DNA 工作液中，混勻后靜置15 min。將混勻后的液體加入細胞培養(yǎng)體系中，輕輕混勻，置于 37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2.1 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例對轉(zhuǎn)染效率的影響 轉(zhuǎn)染前一天鋪細胞于12 孔板，使細胞在轉(zhuǎn)染當天達到匯合度70%。12 孔板中，固定Vigofect用量（1 μL），DNA 轉(zhuǎn)染用量分別為 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。

1.3.2.2 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響 12 孔板中，轉(zhuǎn)染前一天調(diào)整鋪入皿中的細胞數(shù)量，使細胞在轉(zhuǎn)染當天分別達到40%、70%、100%的匯合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 用量為 2.5 μg。

1.3.2.3 接種后培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染效率的影響分別在轉(zhuǎn)染前16 h 及11 h 在12 孔板中鋪入一定數(shù)量 HeLa 細胞，使兩者細胞在轉(zhuǎn)染當天分別達到 70%匯合度。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA用量為 2.5 μg。

以上轉(zhuǎn)染操作均在轉(zhuǎn)染試劑孵育5 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染36 h 后觀察細胞，用倒置熒光顯微鏡拍照，每孔細胞選取3 個視野，進行拍照，通過GFP 熒光表達量，判斷細胞轉(zhuǎn)染效率。利用Image J 軟件統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 Western Blot 檢測

1.3.3.1 收集細胞樣品 棄掉培養(yǎng)基，每個孔中加入 500 μL PBS，清洗細胞，每孔洗 2 遍。每孔中加入 200 μL 2×loading buffer，將細胞刮下，置于1.5 mL EP 管中，100℃煮 10 min，放入-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 SDS-PAGE 凝膠電泳

1）清洗膠槽，組裝。

2）按照表2 配制分離膠和濃縮膠。

表2 分離膠和濃縮膠的配制

取出制備好的樣品上樣量為10 μL，電泳儀設定為 140 V 恒壓，30 min，160 V，1 h 30 min，至溴酚藍跑出膠底邊即可停止電泳。

1.3.3.3 轉(zhuǎn)膜及麗春紅染色 配制轉(zhuǎn)膜緩沖液1 L：100 mL 10×transfer buffer（250 mmol／L Tris-HCl，192 mmol／L甘氨酸 ，ddH2O 中 加 入 30.2 g Tris-HCl，144 g 甘氨酸）+700 mL ddH2O+200 mL無水甲醇。

將PVD 膜置于甲醇中激活5 min。

制作“三明治”轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)：濾紙→膠→PVD 膜→濾紙按順序疊放，在其表層輕輕加transfer buffer。將轉(zhuǎn)膜裝置放入冰水混合物中，轉(zhuǎn)膜2 h。

轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出，浸泡在配制好的麗春紅染色液（2%麗春紅，30%三氯乙酸，30%磺基水楊酸）中，直至條帶顏色完全顯現(xiàn)出來，后轉(zhuǎn)入清水中洗去浮色。

1.3.3.4 裁膜及封閉 裁下β-actin ［相對分子質(zhì)量（Mr）≈4.3×104］作為內(nèi)參，將要檢測的蛋白放在膜的中心位置，將膜剪裁至合適大小并標記好所需抗體名稱。放入清水中。

配 制 1 L TBST buffer：900 mL ddH2O 加 入100 mL 10×TBS （5 mol／L NaCl 275 mL，pH＝7.6 的Tris-HCl 100 mL 補齊至1 L）再加入1 mL 吐溫。

配制封閉使用的牛奶（10%）：稱 10 g 奶粉，加 TBST 至 100 mL，攪拌 5～10 min 至溶解。

將洗好的膜按照與封口垂直的方向放入自封袋中，加入配好的牛奶，沒過膜，塑封機封住開口，37℃ 1 h 或 4℃過夜。

1.3.3.5 孵育一抗、二抗 用牛奶按照1∶1 000的比例配制一抗。封閉結(jié)束后，倒掉牛奶，加入一抗，封膜。4℃過夜或 37℃ 1～2 h。TBST 洗膜 4 遍，每遍5 min。

用 TBST 按照 1∶10 000 的比例配制二抗。將洗膜盒里的TBST 倒干凈，直接在洗膜盒里加入適量二抗，37℃ 1 h 或者室溫 2 h。TBST 洗膜 5遍，每遍 5 min。

1.3.3.6 曝光（化學發(fā)光儀） 將膜移入化學發(fā)光儀中。避光配制化學顯影液。將顯影液滴加到膜上，設置自動曝光參數(shù)（不顯示 marker，曝光 15次），曝光結(jié)束后選擇最合適曝光強度的照片，根據(jù)上樣順序按規(guī)范制作成實驗結(jié)果圖留存。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例對轉(zhuǎn)染效率的影響DNA 轉(zhuǎn)染用量為 0.4 μg、1 μg、2.5 μg 和 6.25 μg。實驗結(jié)果顯示，從表達GFP 細胞數(shù)目（圖1、表1）和蛋白表達水平上看（圖2），隨著DNA 對轉(zhuǎn)染試劑比例的增加，轉(zhuǎn)染效率會逐漸提高，但超過一定限度，隨著DNA 量的增加，轉(zhuǎn)染效率不再提高。這也說明Vigofect 在轉(zhuǎn)染時存在 DNA 轉(zhuǎn)染量的限制，并不是轉(zhuǎn)染的DNA 量越多轉(zhuǎn)染效率越高。對于該實驗體系，DNA 與 Vigofect 的最佳比例為1 μL Vigofect 轉(zhuǎn)染 2.5 μg DNA。

圖1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對轉(zhuǎn)染效率的細胞水平觀察

表1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量條件下細胞熒光數(shù)量統(tǒng)計

圖2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對轉(zhuǎn)染效率的蛋白水平檢測

2.2 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響 實驗室原有固定的轉(zhuǎn)染流程都是在細胞匯合度達到70%時進行轉(zhuǎn)染，因此預測此時轉(zhuǎn)染效率應該最高。但出乎意料的是，實驗結(jié)果提示細胞密度達到 40%時進行轉(zhuǎn)染效率最高（圖3、表2、圖4）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，實驗室原有流程選擇在70%細胞匯合度轉(zhuǎn)染是為了削減轉(zhuǎn)染試劑的細胞毒性作用，在保證細胞處于指數(shù)增長的前提下盡可能獲得更多存活細胞。此次實驗發(fā)現(xiàn)，對HeLa 細胞利用Vigofect 進行轉(zhuǎn)染時，選用40%的細胞匯合度其轉(zhuǎn)染效率更高：固定合適的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA 比例后，其細胞毒性比較小；40%的細胞匯合度，細胞狀態(tài)更好，生長旺盛，攝取外源DNA 的能力也比較強。

圖3 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響的細胞水平觀察

表2 不同細胞轉(zhuǎn)染密度條件下細胞熒光數(shù)量統(tǒng)計

圖4 細胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響的蛋白水平檢測

2.3 轉(zhuǎn)染前細胞培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染效率的影響在孵育之前，通常選擇較高密度接種細胞，在鋪細胞后的16 h 進行轉(zhuǎn)染，因為這樣細胞能以比較好的狀態(tài)貼壁生長且進入指數(shù)增長期，并通常都能達到常用的轉(zhuǎn)染匯合度。但16 h 是否是最佳條件并未驗證。

在本實驗中為了探討細胞接種后培養(yǎng)多長時間進行轉(zhuǎn)染比較好，并能盡量縮短轉(zhuǎn)染實驗的時間，分別選擇了16 h 后轉(zhuǎn)染和11 h 后轉(zhuǎn)染進行對比實驗。分別于轉(zhuǎn)染前 16 h 及11 h 在12 孔板中鋪入相應數(shù)量HeLa 細胞，使細胞在進行轉(zhuǎn)染時匯合度均達到 70%左右。固定 Vigofect 用量（1 μL），DNA 轉(zhuǎn)染用量 2.5 μg。從實驗結(jié)果來看，鋪入細胞11 h 后進行轉(zhuǎn)染的效率略高于16 h 轉(zhuǎn)染的效率（圖5、表3、圖6）。

圖5 轉(zhuǎn)染時間對轉(zhuǎn)染效率的影響的細胞水平觀察

表3 不同轉(zhuǎn)染時間條件下細胞熒光數(shù)量統(tǒng)計

圖6 轉(zhuǎn)染時間對轉(zhuǎn)染效率的影響的蛋白水平檢測

3 總結(jié)與評述

學生所在實驗室經(jīng)常會用轉(zhuǎn)染技術(shù)研究基因和蛋白的功能及調(diào)控機制。實驗室固有流程為細胞接種后16 h，細胞匯合度達到70%時，進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA 時傾向于增加用量，但為什么這樣做，學生并不清楚。

本次探究實驗針對固有流程，以HeLa 細胞為實驗材料，通過調(diào)整轉(zhuǎn)染過程中DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例、轉(zhuǎn)染前細胞培養(yǎng)時間、細胞密度等因素，比較不同條件下轉(zhuǎn)染效率的變化，實現(xiàn)對細胞瞬時轉(zhuǎn)染的條件優(yōu)化的目的。通過之前測試確定，轉(zhuǎn)染試劑孵育時間，以孵育4～6 h 換液轉(zhuǎn)染效率最佳，因此不再考察。

通過這種探究性實驗，學生發(fā)現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染時不一定要按照實驗室的原有經(jīng)驗，轉(zhuǎn)染時細胞密度一定要達到70%，轉(zhuǎn)染一定要等接種后16 h。可適當降低細胞密度，適當提前轉(zhuǎn)染時間，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA 的比例。本實驗中用Vigofect 轉(zhuǎn)染HeLa 細胞時最優(yōu)條件為以合適密度接種細胞后培養(yǎng)11 h 進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時細胞匯合度在 40%～50%，每孔的質(zhì)粒用量為 2.5 μg。既節(jié)省了時間、試劑，還提高了轉(zhuǎn)染效率。

通過本次的探究性實驗，學生體會到方法不是一成不變的，需要不斷探索和優(yōu)化。在繁忙的科研活動中，偶爾做一次簡單的方法優(yōu)化小實驗，不僅可幫助提高科研效率，而且也為科研生活增添了樂趣。