IL-32的結構與功能的生物信息學預測*

劉建兵 李文龍 郝建卿 崔小華 林曉雨 李 莉

（山西醫科大學基礎醫學院細胞生物與遺傳學教研室 山西太原 030001）

生物信息學是由生命科學和信息技術等學科相結合形成的新興交叉學科。利用生物信息學技術，以基因組DNA 序列信息分析作為源頭，獲得蛋白質編碼區的信息后進行蛋白質空間結構模擬和預測，然后依據特定蛋白質的功能進行更深入的研究與應用。白介素-32（Interleukin-32，IL-32）是一種新近發現的促炎細胞因子［1］，其蛋白序列與其他細胞因子不存在同源性，并且在嚙齒類物種中也未找到與其同源的蛋白［2］。IL-32 在人不同組織或器官中都有表達，其中包括脾臟、胸腺、白細胞、肺、小腸、結腸、心臟、胎盤、肝臟、肌肉、腎臟、胰腺和腦等［3］。研究表明，IL-32 在炎癥性疾病、感染性疾病及癌癥發生發展中都發揮著重要作用［3-4］。本研究利用生物信息學方法，對人IL-32蛋白的基本性質、結構、功能及蛋白相互作用等進行了預測和分析，為進一步了解IL-32 基因功能

機制的實驗研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／）數據庫中下載 IL-32 的氨基酸序列進行分析（GenBank 登錄號：AAH09401.1）。

1.2 方法 采用 ProtParam［5］（https://web.expasy.org／protparam／）軟件對 IL-32 蛋白的理化性質進行預測分析；采用ProtScale［5］（https://web.expasy.org／protscale／）軟件對其疏水性進行分析；采用SignalP 4.0［6］（http://www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）對其信號肽結構進行預測分析；采用SecretomeP 2.0 server［7］（http://www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）對其進行非經典型分泌蛋白預測；采用在線程序 TMHMM Server v.2.0［8］（http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）對其跨膜結構進行分析；采用在線軟件NetNGlyc 1.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk／services/NetNGlyc／） 和 Net -OGlyc 4.0 Server［9］（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）對其N-糖基化位點進行預測；采用在線軟件YinOYang1.2 Server［10］（http://www.cbs.dtu.dk／services／YinOYang／）對其 O-糖基化位點進行預測；采用在線軟件 Netphos 2.0 Server［11］（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos-2.0／）對其磷酸化位點進行預測；采用在線軟件 PSORTⅡ［12］（https://psort.hgc.jp／form2.html）對其亞細胞定位分析預測；采用 在線軟件 STRING［13］（https://string-db.org／）對其蛋白網絡互作進行預測分析。

2 結果

2.1 IL-32 蛋白的理化性質分析 利用在線生物信息學軟件ProtParam 對IL-32 蛋白的氨基酸序列進行了理化性質預測分析，結果顯示其蛋白分子量（Mr）=26676.35，蛋白分子式 C1177H1814N318O355S18，理論等電點PI=5.14，屬于酸性蛋白。組成IL-32 蛋白的氨基酸有20 種，其中亮氨酸（Leu）含量最高，占總氨基酸的10.3%，異亮氨酸含量最少，只有0.4%（圖1）。帶負電荷的殘基總數為35 個，帶正電荷的殘基總數為26 個；不穩定指數為56.33，屬于不穩定蛋白；親水性平均總值為-0.495，脂肪指數為67.52。通過在線軟件 ProtScale 分析顯示，IL-32 氨基酸序列的第184 位疏水性最大分值為1.944，第222 位親水性最大分值為-2.256，整體親疏水性預測顯示IL-32 蛋白為親水性蛋白（圖2）。

圖1 IL-32 蛋白氨基酸的組成

圖2 IL-32 蛋白親水性與疏水性分析

2.2 IL-32 蛋白的信號肽分析 生物信息學在線軟件SignalP 4.0 被廣泛應用于蛋白信號肽的預測，結果包含了 C 值、Y 值和 S 值。其中通過 S 平均值判斷分泌蛋白（若S 平均值高于0.500，則為分泌蛋白，且存在信號肽）；C 值是剪切位點值；Y值是綜合考慮C 值和S 值后的一個參數，可更準確判斷信號肽剪切位點。IL-32 蛋白氨基酸序列的信號肽預測結果顯示C 值最大為0.168、Y 值最大為 0.206、S 平均值為 0.226。由此推測，IL-32 蛋白不存在信號肽序列，不是經典的分泌型蛋白（圖3）。

圖3 IL-32 蛋白的信號肽分析

2.3 非經典型分泌蛋白預測 SecretomeP 2.0 server 是預測非經典分泌型蛋白的專業軟件，結果評價主要參考NN-score，哺乳動物序列的閾值為0.6［8］。利用 SecretomeP 2.0a Server SecretomeP 2.0 Server 對 IL-32 蛋白氨基酸序列預測，NN-score 為0.534。由此判斷，IL-32 不是非經典型分泌蛋白。

2.4 IL-32 蛋白的跨膜結構分析 利用在線生物信息學軟件TMHMM Server v.2.0 對IL-32 蛋白氨基酸序列進行跨膜結構預測分析，結果表明：IL-32 蛋白序列全部位于膜外區，不存在跨膜區。

2.5 IL-32 蛋白亞細胞定位 PSORTⅡ在線軟件的the k-NN Prediction 對IL-32 蛋白亞細胞定位預測結果表明，IL-32 定位于不同細胞器的可能性分別為：細胞質（60.9%）、細胞核（17.4%）、線粒體（8.7%）、細胞骨架（8.7%）和高爾基體（4.3%）。

2.6 IL-32 蛋白翻譯后位點修飾 利用生物信息學在線軟件 NetNGlyc 1.0 Sever、NetOGlyc 4.0 Server、YinOYang1.2 Server 和 Netphos 2.0 Server 對IL-32 蛋白的翻譯后糖基化和磷酸化位點修飾進行了預測分析。NetNGlyc 1.0 Sever 和 NetOGlyc 4.0 Server 預測結果表明IL-32 蛋白沒有N-糖基化位點，其O-糖基化位點分別在第34 位、第133 位、第211 位和第 228 位氨 基酸 ；YinOYang1.2 Server 對O-糖基化位點再次進行預測，結果顯示有7 個位點，分別位于第 24 位、第 80 位、第 143 位、第 207位、第 228 位、第 232 位和第 233 位氨基酸。第 228位氨基酸被2 種軟件同時預測為O-糖基化位點。Netphos 2.0 Server 對IL-32 蛋白磷酸化位點預測結果表明，IL-32 蛋白有 14 個 Ser、6 個 Thr、2 個Tyr 可能成為蛋白激酶磷酸化位點。

2.7 IL-32 蛋白相互作用分析 相互作用基因庫檢索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）能構建已知蛋白質與預測蛋白質之間的相互作用。它不僅包括直接的物理相互作用，還包括間接的功能相關，通過對蛋白質之間相互作用的可能性進行打分，評價相互作用可能性的大小。STRING 數據庫預測結果顯示，構成IL-32 蛋白相互作用網絡的蛋白有10 個（圖4），分別為：PRTN3（score:0.984）、CXCL8（score:0.748）、IL18（score:0.722）、IL17A（score:0.713）、IL1B（score:0.702）、HGF（score: 0.658）、IL18RAP （score:0.653）、IDO1 （score:0.644）、DNAJA2（score:0.642）、TSLP（score:0.625）。

圖4 IL-32 蛋白互作網絡

3 討論

IL-32 基因位于人染色體16p13.3，含有8 個外顯子。蛋白質前體由234 個氨基酸殘基組成，目前發現有9 個可變剪接體。IL-32 的表達主要在免疫細胞，在腫瘤細胞、成纖維細胞、角質細胞和內皮細胞中也有表達。

國內、外研究表明，在IL-32 蛋白的9 種剪接體中，只有 IL-32γ 存在N 末端疏水信號肽，而其他剪接體沒有典型的信號肽［3］；從 IL-32 的分布來看，IL-32α 分布于細胞內，而 IL-32β 是被分泌到細胞外［14］，也有研究顯示 IL-32β 分布于內質網中，而在細胞核和質膜中不存在［15］，在人T 細胞中 IL-32β 不被分泌［16］；IL-32 蛋白不存在跨膜區，但是也有研究指出IL-32 在外周血單核細胞中的表達與細胞膜有關聯［17］。由此可見，IL-32 蛋白的作用部位仍存在爭議［18］，還待進一步研究。本研究顯示IL-32 蛋白為不穩定的親水性蛋白，不具有信號肽，既不是經典型分泌蛋白，也不是非經典型分泌蛋白，分布于細胞質（60.9%）、細胞核（17.4%）、線粒體（8.7%）、細胞骨架（8.7%）和高爾基體（4.3%），屬于胞內蛋白。這為 IL-32 蛋白性質的研究添加了新的證據。

糖基化和磷酸化修飾是真核生物內蛋白質翻譯后廣泛存在的重要修飾方式，能調控信號轉導、基因表達、細胞周期等諸多細胞過程，這種修飾的異常與疾病的發生有密切的關聯［19-20］。本研究利用多種不同的在線生物信息學軟件，對IL-32 蛋白的糖基化預測結果表明，IL-32 蛋白不存在N-糖基化位點，但是存在有O-糖基化位點。雖然不同軟件的分析結果不完全一致，這可能是由于不同軟件的算法不一致導致的，但是第228 位氨基酸被共同預測為O-糖基化位點。在磷酸化位點的預測中，有 14 個 Ser、6 個 Thr、2 個 Tyr 被預測為蛋白激酶磷酸化位點。這將為研究IL-32 蛋白在細胞生理活動中的功能及機制提供參考依據。

生物信號傳遞、基因表達調節、能量和物質代謝及細胞周期調控等組成了生命過程的各個環節，而蛋白質是體現生命活動的最終執行者。蛋白質不是獨立地行使功能，而是由許多蛋白質及其他分子形成蛋白質互作網絡而實現的。分析蛋白的相互作用關系，對于了解蛋白質的工作原理及了解蛋白之間的功能聯系都有重要意義。本研究進行的IL-32 蛋白相互作用網絡預測研究顯示，IL-32 蛋白與10 個蛋白具有相互作用的可能性，其中包括白介素家族的IL18、IL17A、IL1B 及IL18的受體輔助蛋白（IL18RAP），這與目前報道的關于IL-32 的功能主要與炎癥有關相一致。其次筆者從 HPA 數據庫（Human Protein Atlas，https：//www.prot-einatlas.org／）查詢發現，在互作蛋白中PRTN3 和CXCL8 在骨髓中顯著高表達，提示IL-32可能與PRTN3 和CXCL8 蛋白相互作用，在骨髓相關疾病中發揮一定的作用；HGF 和IDO1 在胎盤中顯著高表達，提示IL-32 蛋白可能與HGF 和IDO1 相互作用，在人妊娠過程中發揮一定的功能，這為后續研究IL-32 蛋白在人妊娠過程中的功能提供了理論依據。

總之，本研究利用生物信息學的方法對IL-32蛋白的結構、功能及蛋白互作網絡進行了預測分析，為進一步研究IL-32 蛋白在生命活動中的作用機制研究提供了思路和依據。