參蘇丸中4種成分HPLC法測定

曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

參蘇丸是中國藥典收載的品種，由黨參、紫蘇葉、葛根、前胡、茯苓、半夏(制)、陳皮、枳殼(炒)、桔梗、甘草、木香等組成，具有益氣解表、疏風散寒、祛痰止咳等作用，用于身體虛弱、感受風寒所致感冒，癥見惡寒發熱、頭痛鼻塞、咳嗽痰多、胸悶呃逆、乏力氣短等[1]。葛根、陳皮和枳殼為其主藥，現代藥理研究表明，葛根中葛根素、大豆苷元和大豆苷等異黃酮類化合物為有效成分，對心血管系統、免疫系統的疾病有較好的治療作用，其制劑用于治療頭暈頭痛、高血壓病、心絞痛和突發性耳聾等疾患療效顯著,臨床應用廣泛[2]。陳皮中有較高含量的陳皮苷 Hesperidin (亦稱橙皮苷、橘皮苷)，具有維持血管正常滲透壓、降低血管脆性、縮短流血時間等作用。陳皮和枳殼來源于同蕓香科不同種的不同藥用部位，均含有豐富的黃酮類化合物，陳皮主要含有橙皮苷、新橙皮苷，枳殼主要含柚皮苷、新橙皮苷及少量的橙皮苷，且上述黃酮類化合物結構非常相似。為更好地控制藥品質量，本研究參照文獻[3-4]建立了高效液相色譜法測定其中4種成分-葛根素、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(包括G13-11C型四元泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G1314F型紫外檢測器，美國Agilent 公司)；MS205DU電子分析天平(上海梅特勒儀器有限公司)；KQ-300UDB型雙頻數控超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。Hypersil ODS2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)。

1.2 材料 葛根素(批號：110752-201514，含量：95.5%)、柚皮苷(批號：110722-201613含量：94.3%)、橙皮苷(批號：110721-201617，含量：96.1%)、新橙皮苷(批號：111857-201703，含量：99.2%)均購于中國食品藥品檢定研究院。參蘇丸(規格：6 g/袋，批號：20160101、20160103、2017-0503，云南XX藥廠)。甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)線性梯度洗脫(程序見表1)；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：225 nm；進樣量：5 μL。按上述色譜條件，依次取陰性樣品溶液、混合對照品溶液和供試品溶液各5 μL進樣，記錄色譜圖。葛根素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的保留時間依次為：15.2 min、27.2 min、28.8 min、30.3 min；理論板數依次為：13181、39115、43199、49916；4個成分均分離完全，陰性樣品溶液在與混合對照品溶液相應峰處未見色譜峰出現，說明參蘇丸中的其他藥物及輔料對測定無干擾，如圖1所示。

表1 梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取四種對照品(A：16.30 mg；B：15.22 mg；C：15.20 mg；D：14.96 mg)于4個10 mL的量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，搖勻，分別精密量取上述四種對照品溶液2 mL于同一25 mL的量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。作為混合對照品儲備液(A：124.53 μg/mL；B：114.82 μg/mL；C：116.86 μg/mL；D：118.72 μg/mL);再精密吸取2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 取樣品適量，研細，精密稱取約1.0 g，置于100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率240 W，頻率45 KHz)40 min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 取不含葛根的參蘇丸處方與不含枳殼和陳皮的參蘇丸處方，按參蘇丸[1]制法制備不含葛根與枳殼和陳皮的陰性樣品，按“2.3”項下的制備方法制備陰性樣品溶液，即得。2.5 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2.5、5、10 mL于10 mL的量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，計算回歸方程，結果見表2。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，連續進樣5次，A、B、C、D峰面積的RSD(n=5)分別為0.59%、0.51%、0.64%、0.54%。結果表明進樣精密度良好。

2.7 重復性試驗 取批號20160103的樣品，研細，精密稱取約1.0 g，共5份。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項下的方法測定，記錄色譜圖，結果A、B、C、D含量的RSD(n=5)分別為1.1%，0.82%，1.0%，0.79%，表明方法重復性良好。

表2 4種成分的線性回歸方程

2.8 穩定性試驗 按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、16、24 h進樣測定，記錄峰面積、結果A、B、C、D的峰面積的RSD依次為：0.86%、0.79%、0.92%、0.77%。結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取準確測定含量批號為“20160103”的樣品，研細，精密稱取約0.5 g，共6份，分別加入對照品溶液(A:1556.6 μg/mL，B:1435.2 μg/mL，C:1460.7 μg/mL，D:1484.0 μg/mL)各1 mL，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣，計算A、B、C、D的平均回收率(n=6)和RSD，結果見表3，結果表明回收率良好。

2.10 樣品含量測定 取3批次樣品，各3份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄峰面積，以外標法計算各成分含量，結果見表4。

表3 回收率試驗結果 (n=6)

表4 樣品含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 試驗中曾采用0.1%磷酸溶液，甲醇，乙腈，水作為流動相[3-4]，但在試驗過程中甲醇—水為流動相峰型好，且分離效果良好，故選擇甲醇—水為流動相。

3.2 實驗中樣品提取 曾采用水，稀乙醇、乙醇、甲醇等溶劑，結果顯示甲醇提取效果較好。同時考察了超聲提取，加熱回流提取方式，結果兩者差異不大，但超聲提取簡便、快捷，故選擇超聲提取；試驗過程中比較了超聲提取(功率240 W，頻率45 KHz)20、30、45、60、90 min的提取效果，結果顯示超聲提取(功率240 W，頻率45 KHz)45、60、90 min的結果一致，故選擇超聲提取(功率240 W，頻率45 KHz)45 min為提取時間。

參蘇丸是中國藥典收載的品種，葛根、陳皮和枳殼均為其主藥，且葛根素、油皮苷、橙皮苷、新橙皮苷又是其主藥成分。通過該方法可以有效控制參蘇丸中葛根、陳皮、枳殼的質與量。在測定過程中、樣品的分離度較好、陰性樣品無干擾、方法簡便，快捷，準確、一法可控制該處方中多味藥材的質與量。