金銀花中酚酸類有效成分的提取及其抗菌活性研究

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.佳木斯市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 佳木斯 154002；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；

金銀花是忍冬科多年生常綠纏繞灌木忍冬(LonicerajaponicaThunb. )的干燥花蕾[1]。具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能，臨床主要應(yīng)用于瘡瘍、瀉痢、外感、熱病及呼吸道感染等疾病[2-3]。研究表明，金銀花中主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類、三萜類等成分，其中酚酸類成份具有較好的抑菌效果[4-5]。研究以酚酸類為指標(biāo)考察金銀花的最佳提取方法，并對(duì)其提取物進(jìn)行抗菌活性考察，為金銀花在細(xì)菌感染疾病的治療提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱(中國(guó)哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)、分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、移液槍(Eppendorf)、TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料 綠原酸對(duì)照品購(gòu)自(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，金銀花購(gòu)自北京同仁堂，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

2 方法

2.1 改良石硫法提取金銀花 取金銀花50 g，加15倍量水，浸提2 h，過(guò)濾，濾渣再加10倍量水浸提1.5 h，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，緩緩加入20%的石灰乳調(diào)pH值至10左右，離心，沉淀物，加入2倍量95%乙醇研磨成漿，加50%硫酸調(diào)pH值至3左右，充分?jǐn)嚢瑁x心，離心液加40% NaOH調(diào)pH值至6左右，回收乙醇，減壓烘干，得粗提物。

粗提物溶于2～3倍量水中，鹽酸調(diào)pH值至2，乙酸乙酯萃取數(shù)次，萃取液用活性碳脫色，過(guò)濾，濾液濃縮后，分次加入適量氯仿，過(guò)濾沉淀，常壓干燥，得淡黃色浸出物并計(jì)算浸出物含量。

2.2 水提正丁醇萃取法提取金銀花 取金銀花50 g，加10倍量水，80 ℃浸提2次，每次2 h，過(guò)濾并合并濾液，濃縮，濃縮液用50%硫酸調(diào)pH值至3，正丁醇萃取3次，合并萃取液，調(diào)pH值至6～7，減壓回收，濃縮干燥，得淡黃色浸出物并計(jì)算浸出物含量。

2.3 乙醇回流提取法提取金銀花 取50 g金銀花，加10倍量50%乙醇，80 ℃加熱回流2次，每次1 h，過(guò)濾并合并濾液，減壓濃縮，調(diào)濃縮液pH值至2左右，加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，并用適量水洗滌2次，以40%NaOH調(diào)pH值至6～7，取水層減壓濃縮至稠膏，再干燥，得浸出物并計(jì)算浸出物含量。

2.4 水提醇沉法提取金銀花 取50 g金銀花，加10倍量水，80 ℃浸提3次 ,每次1.5 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，加入乙醇，冷藏24 h，濾過(guò)，濾液減壓真空干燥，得浸出物并計(jì)算浸出物含量。

2.5 酚酸類成分的含量測(cè)定

2.5.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mg置于10 mL容量瓶中，娃哈哈純凈水定容，并稀釋配制成濃度為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以中國(guó)藥典規(guī)定的324 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度(A)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度C作為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。

2.5.2 精密度測(cè)定 取綠原酸對(duì)照品溶液(5.0 μg/mL)6份，按2.5.1測(cè)定方法連續(xù)測(cè)定，記錄 A值，計(jì)算RSD值。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取5 mg提取物樣品6份，加至10 mL容量瓶中，娃哈哈純凈水定容，按2.5.1測(cè)定方法連續(xù)測(cè)定，記錄 A值，計(jì)算RSD值。

2.5.4 加樣回收率測(cè)定 分別精密稱取16 mg已知含量的提取物樣品(綠原酸含量100 μg)6份，至50 mL容量瓶中，加入綠原酸對(duì)照品100 μg，加水定容，按2.5.1測(cè)定方法測(cè)定A值，并計(jì)算平均回收率與RSD值。

2.5.5 穩(wěn)定性測(cè)定 取樣品溶液(綠原酸20 μg/mL)5mL，按2.5.1方法測(cè)定A值，每隔15 min測(cè)定一次，測(cè)定2 h，計(jì)算RSD值。

2.5.6 酚酸類成分的含量測(cè)定 精密稱取各提取物5 mg，置于10 mL的容量瓶中，娃哈哈純凈水定容，再精密吸取溶液1 mL，置于10 mL的容量瓶中，娃哈哈純凈水定容，得到供試品溶液。將供試品溶液在324 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 A，計(jì)算各提取物中酚酸類成份的含量。

2.6 金銀花提取物的抑菌效果考察 分別取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌懸液各0.2 mL，注入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入15 mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻，冷卻制備含菌平板，將每個(gè)含菌平板均分成4等份，每份正中處輕放一無(wú)菌牛津小杯，在牛津小杯中分別注入濃度為30%的不同金銀花提取物水溶液，36 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量每個(gè)牛津小杯所對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 酚酸類成分測(cè)定的方法學(xué)考察 以濃度C為x軸，吸光度A為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為C=0.0371A+0.0098，r=0.9997，表明綠原酸在1～9 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的RSD值分別為0.33%、0.54% 和0.99%，均符合藥典規(guī)定，表明此方法的精密度、重復(fù)性良好，且2 h內(nèi)藥物穩(wěn)定。此外，本測(cè)定方法的平均加樣回收率為97.14%，RSD值為1.30%，表明此方法準(zhǔn)確度良好。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明此方法符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，可用于酚酸類成分的含量測(cè)定。

3.2 金銀花提取方法考察 由表1可知，水提醇沉法制得的浸出物含量最高，而改良石硫法制得的浸出物含量最低；以酚酸類成分的含量為考察對(duì)象，則改良石硫法的總酚酸含量最高，乙醇回流提取法次之。其中改良石硫法，水提正丁醇萃取法和水提醇沉法均為水提，但是結(jié)果卻相差甚大，說(shuō)明酚酸類成分在3種提取方法的純化步驟中損失差異較大。

提取物改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提取法水提醇沉法浸出物含量/%11.40±0.02618.09±0.3537.49±0.7164.681±0.29酚酸類含量/mg/g68.87±1.2542.83±3.2764.32±0.8516.68±0.97

3.3 金銀花提取物抑菌效果 由表2可知，除改良石硫法和乙醇回流提取法制備的金銀花提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果無(wú)顯著性差異外，不同提取方法制得的金銀花提取物對(duì)同一菌株的抑菌效果均具有顯著性差異，且改良石硫法制得的金銀花提取物對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈直徑均為最大，表明此法制得的提取物抑菌效果最好。在表1中改良石硫法制得的金銀花提取物中酚酸類含量最高，而酚酸類能夠引起細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP 等大分子物質(zhì)泄漏，膜電位破壞，最終具有抑菌、殺菌效果。本研究結(jié)果表明表2與表1結(jié)果一致，均表明改良石硫法制得的金銀花提取物具有最佳的抑菌效果。

細(xì)菌改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提取法水提醇沉法枯草芽孢桿菌2.41±0.035a2.09±0.020b2.41±0.036a1.90±0.031c金黃色葡萄球菌2.61±0.025a2.22±0.025b2.42±0.031c1.83±0.021d大腸桿菌3.47±0.042a2.60±0.035b2.40±0.020c2.20±0.035d綠膿桿菌2.72±0.049a2.25±0.050b2.63±0.025c1.91±0.031d

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)分別考察了改良石硫法、水提正丁醇萃取法、乙醇回流提取法和水提醇沉法制得的金銀花浸出物含量，測(cè)定了各提取物中酚酸類成分的含量，并評(píng)價(jià)了各提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌效果。結(jié)果表明，水提醇沉法的浸出物含量最高，但其酚酸類的含量最低、抗菌活性最差，改良石硫法制得的金銀花提取物中酚酸類成分含量最高、抗菌效果最佳。因此，治療細(xì)菌感染性疾病可用改良石硫法制備金銀花提取物。