白藜蘆醇苷的體外抗氧化活性研究

泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300

白藜蘆醇苷(polydatin，PD)即3,4′5-三羥基-3-β-D-吡喃葡萄糖苷，是傳統中藥虎杖中的有效成分，具有抗癌、抗凋亡、調控細胞增殖與自噬等藥理活性[1-2]，另外，白藜蘆醇苷能夠通過抗炎進而發揮對心血管系統的保護作用[3]。研究發現，多種心血管疾病都伴隨著氧自由基的過量生成，并且機體過度氧化應激能夠參與心血管疾病的發生和發展[4-5]。因此，應用抗氧化活性物質、增強機體抗氧化防御系統，改善機體氧化應激狀態，可能成為心血管疾病新的治療靶向。研究以白藜蘆醇苷為研究對象，考察其體外抗氧化活性，以期為白藜蘆醇苷的心血管疾病保護作用提供一定的理論基礎和依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；MS204TS型分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料 白藜蘆醇苷(批號：15721)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH，批號：D9132)、1,10-菲羅啉(批號：GG240128)均購自美國Sigma-Aldrich公司；鐵氰化鉀(批號：DF230103)、硫酸亞鐵(批號：GD260142)、硫代巴比妥酸(批號：FA090131)、三氯乙酸(批號：DG100100)購自薩恩化學技術(上海)有限公司；乙醇(批號：20180706)、H2O2(批號：20180615)為國藥集團化學試劑有限公司，所有均為分析純。

2 方法

2.1 白藜蘆醇苷對羥基自由基清除能力的測定 取2.1 mM 1,10-菲羅啉溶液1 mL置入試管中，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和1 mL雙蒸水混勻，再加入1 mL硫酸亞鐵溶液混勻，最后加入1 mL H2O2溶液，37 ℃溫育60 min，在536 nm波長下測定吸光度，為A(損)；用1 mL蒸餾水代替H2O2，測的吸光度值為未損傷管A(未)；用不同濃度樣品溶液代替雙蒸水，測出的吸光度為A(樣)。

清除率(%)=[A(樣)-A(損)]/[A(未)-A(損)]×100

2.2 白藜蘆醇苷對DPPH自由基清除能力的測定 取不同濃度樣品溶液2 mL和DPPH·溶液2 mL加入到試管中搖勻、室溫靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度值 Ai；在2 mL DPPH·標準溶液中加入2 mL無水乙醇，震蕩混合，在517 nm波長處測定吸光度值A0；試管中加入2 mL不同濃度的樣品溶液和2 mL無水乙醇，搖勻、避光放置30 min后，在517 nm波長處測定吸光值Aj。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2.3 白藜蘆醇苷對脂質過氧化物抑制作用的測定 新鮮雞蛋去卵清，卵黃用等體積的PBS緩沖液配制成1∶1的卵黃懸液，同方向勻速攪拌10 min，再用PBS稀釋成1∶25的卵黃懸液。吸取卵黃懸液 0.2 mL，分別加入0.1 mL不同濃度樣品溶液，0.2 mL 25 mM硫酸亞鐵溶液，加入1.5 mL PBS緩沖液，在37℃水浴下反應30 min，加1 mL 20%三氯乙酸，混勻3500 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加1 mL 0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min冷卻后532 nm下測定吸光度值，以0.1 mL蒸餾水代替樣品作為空白對照管。

清除率=(A0-A)/A0×100%；其中，A0為空白對照管吸光度，A為樣品吸光度。

2.4 白藜蘆醇苷還原鐵離子能力的測定 在試管中加入0.5 mL樣品溶液，2.5 mL的PBS緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液，震蕩均勻，50℃水浴20 min，流水冷卻，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液。混勻后，用3000 r/min離心10 min。吸取上清液2.5 mL置于新的離心管中，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液，混合均勻后，用紫外分光光度計在700 nm波長下測定吸光度。吸光度越大表明樣品還原能力越強。

3 結果

3.1 白藜蘆醇苷對羥基自由基清除的影響 機體過量的自由基則會引起蛋白質變性、酶失活、多糖降解、DNA鏈斷裂、生物膜結構損傷、細胞解體乃至機體病變和死亡。從圖1可知，隨著白藜蘆醇苷濃度增加，其對羥基自由基的清除率逐漸增大，提示白藜蘆醇苷具有一定的清除羥基自由基的作用。

3.2 白藜蘆醇苷對DPPH·自由基清除的影響 DPPH自由基溶液在517 nm處有強吸收，每個DPPH分子在溶液中可生成一個穩定的含氮自由基，具有典型紫色，當它與提供1個電子的自由基清除劑作用時，生成無色產物，使溶液的典型紫色變淺。由圖2可知，隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率增大。當白藜蘆醇苷濃度為0.5 mg/mL時，DPPH 自由基清除率為48.05%，揭示白藜蘆醇苷具有一定的體外抗氧化活性。

3.3 白藜蘆醇苷對脂質過氧化物抑制作用的影響 過氧化脂質降解產生的丙二醛，與硫代巴比妥酸發生縮合反應生成紅色產物，在 532 nm處有最大吸收。隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，白藜蘆醇苷對卵黃脂蛋白體系中脂質過氧化作用抑制率也隨之增加，其抑制作用與白藜蘆醇苷濃度呈現一定的量效關系。從圖3可知，白藜蘆醇苷對卵黃脂蛋白脂質過氧化物具有一定的抑制作用。

3.4 白藜蘆醇苷還原鐵離子能力的測定 一般情況下，物質的還原能力與其抗氧化能力成正比，還原能力強的物質可作為電子供體，使自由基變成穩定形態，從而起到抗氧化的作用。在該反應過程中，Fe3+可被抗氧化物質還原成為Fe2+后在700 nm波長下具有強吸收。因此，吸光度越大表明樣品還原能力越強。由圖4可知，隨著白藜蘆醇苷濃度的增加，體系吸光度越大，表明白藜蘆醇苷具有一定的還原力。

4 討論

羥基自由基、過氧化氫及超氧陰離子自由基等是生物體內主要的活性氧自由基，它們引發體內脂質過氧化是機體衰老、動脈粥樣硬化、心血管疾病及腫瘤發生的重要原因。因此，有關抗氧化清除自由基的作用以及天然抗氧化活性小分子化合物篩選得到普遍的關注。研究從白藜蘆醇苷對羥基自由基和DPPH·自由基的清除作用，對脂質過氧化物的抑制作用和鐵離子的還原能力4個方面對白藜蘆醇苷的體外抗氧化進行了研究。結果表明，白藜蘆醇苷能夠清除羥基自由基和DPPH自由基，并且具有一定的脂質過氧化物抑制和鐵離子還原能力。因此，白藜蘆醇苷具有一定的體外抗氧化活性，可能作為潛在的抗氧化劑。

有研究表明，氧化應激在心血管疾病的發生發展過程中發揮著至關重要的作用[6]。本實驗表明，白藜蘆醇苷在體外具有一定的抗氧化活性，這可能為揭示白藜蘆醇苷的心血管疾病保護作用提供一定新的理論基礎。