天麻普通粉、破壁粉、凍干粉對(duì)戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的影響

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.張家口市第五醫(yī)院，河北 張家口 075000；3.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550014

驚厥是由多種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞異常運(yùn)動(dòng)，臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性、全身性和陣發(fā)性的肌肉抽動(dòng)，伴有眼球上翻、意識(shí)障礙，主要好發(fā)于兒童的一類神經(jīng)疾病[1]。驚厥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常以神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡紊亂為主。神經(jīng)遞質(zhì)包括抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在抗驚厥方面發(fā)揮重要作用[2]。GABA受γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨梅(γ-aminobutyrate transaminase,GABA-T)催化降解，GABA-T活性增強(qiáng)已成為驚厥發(fā)病的一個(gè)重要因素[3-4]。天麻化學(xué)成分含有天麻素、天麻甘元、香莢蘭醇多糖等，其活性成分主要以酚類及多糖為主，具有抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗衰老等藥理作用[5]。破壁粉碎技術(shù)是將傳統(tǒng)飲片加工粉碎至D90<45 μm的粉體，無需添加任何輔料制成中藥破壁飲片，提高生物利用度的一種技術(shù)[6]。凍干技術(shù)是將中藥材在真空狀態(tài)下冷凍，通過水的升華除去水分，已被國(guó)家列入“21世紀(jì)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展戰(zhàn)略”之一的一種干燥技術(shù)[7]。研究以大鼠為對(duì)象，探討天麻(普通粉、破壁粉、凍干粉)對(duì)戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的影響，初步探討不同工藝的天麻治療驚厥的療效和作用機(jī)制，為后期臨床和實(shí)驗(yàn)研究使用天麻破壁粉和凍干粉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 72只清潔級(jí)SD大鼠，體重為(200±20)g，購(gòu)自于慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。

1.2 藥物 天麻來源為自采，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。普通粉：60 ℃中烘干，研磨粉碎后過6號(hào)篩制成；破壁粉：60 ℃中烘干，應(yīng)用破壁粉碎技術(shù)加工、干壓制成粉粒；凍干粉：真空干燥機(jī)將切制、滅菌的新鮮天麻凍干，小鋼磨粉碎后，最后過藥典6號(hào)篩篩選制成。

1.3 試劑 丙戊酸鈉(批號(hào)：8HG0385，賽諾菲制藥有限公司)；戊四唑 (批號(hào)：#L16185，深圳市華宇能通訊科技有限公司)；TRNzol總RNA提取試劑(批號(hào)：DP405-02，天根生化科技(北京)有限公司)；DL2000 DNA Marker(批號(hào)：3427Q，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；Ultrapure RNA Kit(批號(hào)：CW0581M，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(批號(hào)：Q221-01，南京諾唯贊生物科技有限公司)；一步法快速WB(HRP)試劑盒(兔)(批號(hào)：CW02029)、一步法快速WB(HRP)試劑盒(鼠)(批號(hào)：CW02030)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：CW0014)均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 儀器 Step One Plus型熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；C2500型低溫離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠)；ZS-2型板式酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機(jī)電有限公司)；164-5050型電泳儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白電泳槽(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組 72只健康成年SD大鼠，將大鼠適應(yīng)性養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為12組，每組6只，然后稱重、標(biāo)記。分組：正常組，模型組(戊四唑)，陽(yáng)性對(duì)照組(丙戊酸鈉)組，天麻普通粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)，天麻破壁粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)，天麻凍干粉低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg)。

2.2 造模及給藥 正常對(duì)照組用生理鹽水灌胃(4 mL/kg)；模型組用戊四唑腹腔內(nèi)注射(0.08 g/kg)；陽(yáng)性對(duì)照組戊四唑腹腔內(nèi)注射 (0.08 g/kg)，再給予丙戊酸鈉灌胃(0.12 g/kg)，持續(xù)10 d；藥物組戊四唑腹腔內(nèi)注射 (0.08 g/kg)，分別給予天麻(普通粉、破壁粉、凍干粉)低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1 g/kg、2 g/kg)灌胃，使藥物均勻溶解，連續(xù)給藥10 d，并給予適宜環(huán)境生長(zhǎng)，自由進(jìn)水進(jìn)食。在給藥之后把大鼠單獨(dú)放在鼠籠里并觀察大鼠30 min的形力學(xué)改變，驚厥診斷參照Racine標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)作等級(jí)，選擇發(fā)作等級(jí)大于Ⅳ的進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。[8]

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 對(duì)戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠GABA-T mRNA表達(dá)量的影響 按照超純RNA試劑盒說明從大鼠海馬組織制備總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，60 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)40個(gè)。目的基因作為引物和以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度270 bp；GABA-T上游引物序列5′-CTTTCTGTTCTCAACTC-3′，下游引物序列5′-TGAATACTCTGCCCTGCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。PCR實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)Real-time PCR原始數(shù)據(jù)Ct值，并計(jì)算相對(duì)定量值。

2.3.2 對(duì)戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織樣本中GABA-T蛋白表達(dá)量的影響 稱取適量大鼠海馬組織加入適量RIPA(細(xì)胞裂解液)裂解液勻漿后，10000 rpm離心20 min，然后取上清液，按BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在凝膠電泳槽中加入制備好的蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，取膜。封閉液封閉后，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液(一抗GABA-T濃度(1∶1000)、二抗GABA-T濃度(1∶200)，一抗內(nèi)參β-actin濃度(1∶5000)、二抗內(nèi)參β-actin濃度(1∶200)。混勻，放入PVDF(聚偏氟乙烯)膜，ECL(電致化學(xué)發(fā)光)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，開始曝光。掃描膠片并保存，凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。目的蛋白表達(dá)量與同一樣本內(nèi)參表達(dá)量之比可以計(jì)算出目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA表達(dá)量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組和不同工藝的天麻組均可顯著降低GABA-T mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，且天麻凍干粉高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的GABA-T mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。天麻凍干粉中劑量組對(duì)GABA-T mRNA表達(dá)的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組(P<0.05)。見表1。

組別劑量/g/kgGABA-TmRNA正常組-1.00±0.08模型組0.084.33±0.191)陽(yáng)性對(duì)照組0.122.63±0.421)2)天麻普通粉低劑量組0.54.11±0.301)3)天麻普通粉中劑量組13.65±0.061)2)3)天麻普通粉高劑量組23.38±0.241)2)3)天麻破壁粉低劑量組0.53.93±0.481)3)天麻破壁粉中劑量組13.42±0.521)2)3)天麻破壁粉高劑量組22.94±0.691)2)天麻凍干粉低劑量組0.53.66±0.441)2)3)天麻凍干粉中劑量組12.89±0.481)2)天麻凍干粉高劑量組22.67±0.501)2)

注：與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3)P<0.05。

3.2 戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達(dá)量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和不同工藝的天麻組均可不同程度降低GABA-T蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。相同劑量下，天麻因加工工藝不同對(duì)大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達(dá)量也不同，整體蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)：普通粉>破壁粉>凍干粉。見圖1、2。

4 討論

驚厥是以神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)放電、大腦功能暫時(shí)性失常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。廣泛分布于腦內(nèi)的GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在抗驚厥中發(fā)揮著重要作用，GABA經(jīng)谷氨酸合成，通過GABA-T催化生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫羧酶的催化下生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，GABA-T是GABA的代謝過程中的關(guān)鍵酶[9]。研究表明，GABA-T抑制劑可以提高機(jī)體腦內(nèi)的GABA濃度，且這類抑制劑對(duì)驚厥機(jī)體大腦有高度選擇性作用，所以GABA-T可以作為治療驚厥的一個(gè)重要靶點(diǎn)[10]。目前驚厥的治療集中于對(duì)癥治療和控制療法，難于對(duì)因治療和根治，臨床療效較差，西醫(yī)藥物治療一般使用苯二氮卓類、苯巴比妥類等藥物，但不良反應(yīng)較多。天麻具有祛風(fēng)止痙、平肝熄風(fēng)等功效，其在改善驚厥的臨床癥狀、恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞功能、延長(zhǎng)發(fā)作間歇期、減少?gòu)?fù)發(fā)等方面占有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11]。抗癇膠囊(主要藥物含有天麻)可以明顯降低GABA-T的活性而達(dá)到治療驚厥的作用[12]。

天麻破壁粉是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片粉碎成D90<45 μm的粉體，以不同濃度的乙醇或水作為黏合劑制成30～100目的一種新型飲片。中藥飲片發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)主要是藥物中的有效活性成分，但大多藥物的活性成分在細(xì)胞內(nèi)部。當(dāng)天麻經(jīng)破壁技術(shù)加工后，其細(xì)胞壁被打破，提高天麻在體內(nèi)的釋放速度和吸收程度；天麻粒徑減小、表面積增大，提高有效成分的溶出，因此與傳統(tǒng)飲片相比更利于細(xì)胞內(nèi)的有效成分的釋放，從而大大提高了藥物活性成分的溶出率[13]。鄧銀愛等[14]研究在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)變化，黃芪破壁飲片的生物利用度較黃芪傳統(tǒng)飲片高。林偉波[15]研究參芪固本方對(duì)大腸癌化療后造血系統(tǒng)改善作用，發(fā)現(xiàn)同等劑量時(shí)破壁飲片療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)飲片。

天麻凍干粉是將其在低溫條件下經(jīng)現(xiàn)代提取工藝制備而成的新劑型，其制備過程中隔絕空氣。因此凍干技術(shù)有效地抑制了熱敏性物質(zhì)發(fā)生生物、化學(xué)或物理變化，保存了天麻的活性物質(zhì)，使天麻成分穩(wěn)定性增高，不易發(fā)生化學(xué)變質(zhì)，改善了鮮天麻不易保存的缺點(diǎn)[16]。研究表明，新鮮天麻經(jīng)過真空冷凍干燥工藝研究，其天麻素保留率可達(dá)0.67%。陳艷芬等[17]在研究決明子配方顆粒的藥效學(xué)，結(jié)果顯示決明子配方顆粒藥效總體優(yōu)于傳統(tǒng)水煎液，其中以冷凍顆粒藥效最好。張興盈[18]在不同加工工藝的云當(dāng)歸抗凝血作用比較中，發(fā)現(xiàn)真空干燥成的凍干云當(dāng)歸抗凝血作用比其它加工工藝(鼓風(fēng)干燥、微波干燥、自然曬干)的云當(dāng)歸效果好，同等劑量時(shí)其利用率提高。

研究發(fā)現(xiàn)，天麻凍干粉中劑量組對(duì)GABA-T mRNA表達(dá)的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組(P<0.05)；同等劑量下，天麻破壁粉對(duì)GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用高于天麻普通粉。因此，天麻破壁粉、凍干粉均能提高對(duì)驚厥大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，且整體效果呈現(xiàn)凍干粉的效果優(yōu)于破壁粉，破壁粉的效果優(yōu)于普通粉，其作用機(jī)制可能是不同加工工藝的天麻調(diào)節(jié)GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的差異與天麻粉碎粒徑大小和干燥方式有關(guān)，本研究為天麻凍干粉、破壁粉的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但不同干燥和粉碎技術(shù)對(duì)天麻抗驚厥有效成分的差異性，有待進(jìn)一步研究證實(shí)明確。