前列腺特異性膜抗原顯像劑68Ga-PSMA11標(biāo)記和小動(dòng)物顯像研究

張 驥，許曉平，劉 成，張建平，羅建民，劉 暢，胡四龍，宋少莉，章英劍

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2. 上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 201315；

3. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032；

4. 上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海 200032；

5. 復(fù)旦大學(xué)核物理與離子束應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

前列腺癌是現(xiàn)階段威脅男性健康的惡性腫瘤之一。隨著生活水平的提高，近年來前列腺癌發(fā)病率日益上升，并已成為惡性腫瘤中發(fā)病率增速最快的病種。前列腺癌多發(fā)于中老年男性，在大城市尤為頻發(fā)。根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，其發(fā)病率為3.35%（居男性惡性腫瘤發(fā)病率第6位），環(huán)比上漲0.1%。

前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA），又稱為Ⅰ型葉酸水解酶或Ⅱ型谷氨酸羧肽酶［1］，在所有前列腺癌細(xì)胞表面都過度表達(dá)，且在低分化、轉(zhuǎn)移性和雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)一步增多，而在正常組織如腦、腸道及腎臟中的表達(dá)還不到前列腺癌細(xì)胞的1/1 000［2］。

PSMA可作為診斷和治療前列腺癌的重要靶點(diǎn)。靶向PSMA的小分子抑制劑因其在血液中能被快速清除等特性，已成為構(gòu)建前列腺癌診斷的首選分子影像探針［3-4］。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科先前制備了新型PSMA小分子抑制劑顯像劑99mTc-HYNIC-Glu-Urea-A［5-6］，在SPECT/CT臨床顯像研究中取得不錯(cuò)的效果［7-8］。近期，本科室引入鍺鎵發(fā)生器，開始制備研究68Ga標(biāo)記的正電子顯像劑68Ga-PSMA11。本研究旨在報(bào)道68Ga-PSMA11的標(biāo)記和質(zhì)控方法，以及其在前列腺癌小動(dòng)物模型中的PET/CT顯像效果。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

PSMA11購自江蘇華益科技有限公司；醋酸鈉、HCl溶液購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；無水乙腈購自美國SIGMA公司；高效液相層析級(jí)乙腈購自上海沃凱化學(xué)試劑公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國GIBCO公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）及0.25%胰蛋白酶購自法國BIOWEST公司；0.22 μm無菌過濾器購自美國Millipore公司；薄層色譜紙購自美國Agilent公司。

3只嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠，雄性，約20 g，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；人前列腺癌細(xì)胞LNCaP（PSMA表達(dá)陽性），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由本科細(xì)胞室保存、培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

68Ge/68Ga鍺鎵發(fā)生器為德國Eckert & Ziegler公司IGG100-50M；小動(dòng)物PET/CT檢查儀器為SIEMENS Inveon PET/CT；放射性高效液相色譜儀（Radio-HPLC）為美國Agilent公司1200系列高效液相色譜儀（配德國RAYTEST公司GABI放射性檢測(cè)器）；放射性薄層液相色譜儀（Radio-TLC）為德國RAYTEST公司miniGITA。上述設(shè)備均為本科室所有。

1.3 藥物標(biāo)記方法

取5 mL的0.1 mol/L HCl溶液，緩慢注射到鍺鎵發(fā)生器進(jìn)行淋洗，待排出1.5 mL左右淋洗液時(shí)開始收集淋出液體（HCl體系68GaCl3奶液，約1.3×109Bq，3.5 mL）。

稱取60 μg PSMA11前體，加入1.2 mL的1.5 mol/L醋酸鈉溶液，再向該體系加入全部上述新鮮淋洗的68GaCl3奶液，100 ℃加熱反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將體系中的液體經(jīng)0.22 μm針式無菌過濾器除菌。

1.4 質(zhì)量控制方法

1.4.1 性狀檢查

置于鉛玻璃后目測(cè)產(chǎn)品顏色與澄明度，并用精密pH試紙測(cè)定注射液pH值。

1.4.2 放射性核純度測(cè)定

采用 γ 能譜儀及半衰期測(cè)定法測(cè)定68Ga放射性核純度。

1.4.3 放射化學(xué)純度測(cè)定

1.4.3.1 薄層液相色譜法

用毛細(xì)管蘸取少量樣品，點(diǎn)于紙色譜帶1 cm左右起點(diǎn)處，以50%乙腈水溶液為展開劑展開。使用Radio-TLC進(jìn)行掃描，各組分比移值（Rf）見表1。

表 1 68Ga標(biāo)記可能產(chǎn)物的Rf值

1.4.3.2 反向高效液相色譜法

色譜柱為Agilent ZOBRAX 300SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相為水/0.1%三氟乙酸/乙腈。洗脫條件為0～15 min，10%～60%乙腈、紫外檢測(cè)（波長(zhǎng)220 nm）和放射性檢測(cè)。

1.4.4 放射性濃度計(jì)算

精密量取1 mL68Ga-PSMA11注射液，用活度計(jì)測(cè)量其放射性活度并計(jì)算放射性濃度。

1.4.5 異常毒性檢查

按2015版《中華人民共和國藥典》進(jìn)行差異毒性檢查。取5只正常昆明小鼠，尾靜脈注射7.4×107Bq68Ga-PSMA11注射液（成人劑量千倍），48 h內(nèi)觀察小鼠有無不良反應(yīng)或死亡。

1.4.6 無菌檢查

分別取68Ga-PSMA11注射液1 mL，用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)72 h。

1.4.7 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2015版《中華人民共和國藥典》，采用鱟試劑法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1.4.8 無菌過濾器完整性檢查

將無菌過濾器加壓至0.2 MPa，檢查其是否漏氣。

1.5 生物學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.5.1 腫瘤模型建立

將凍存的人前列腺癌細(xì)胞LNCaP復(fù)蘇后接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10% FBS），置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，用50% Matrigel基質(zhì)膠制成密度為1×107個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。

均勻吸取200 μL細(xì)胞懸液（每只），皮下注射于SCID小鼠右上肢。在本科室動(dòng)物房獨(dú)立通氣籠盒（individual ventilated cages，IVC）內(nèi)正常飼養(yǎng)4～6周，待實(shí)體瘤生長(zhǎng)至直徑7～8 mm時(shí)用于顯像。

1.5.2 小動(dòng)物PET/CT成像

取LNCaP荷瘤模型小鼠3只，尾靜脈注射68Ga-PSMA11注射液（3.7×106Bq，200μL）后，將小鼠用1.5%異氟烷/氧氣進(jìn)行呼吸麻醉并固定于PET/CT上，動(dòng)態(tài)采集圖像2 h。然后利用儀器配置的軟件進(jìn)行圖像處理和數(shù)據(jù)分析，觀察并分析藥物在體內(nèi)腫瘤靶點(diǎn)及不同臟器內(nèi)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 68Ga-PSMA11質(zhì)量控制

2.1.1 性狀檢查

68Ga-PSMA11為無色澄明溶液，pH范圍為5.0～6.0。

2.1.2 放射性核純度

用γ能譜儀法測(cè)定，能量譜圖上除511 keV和1 077 keV外，無其他峰（圖1）。

圖 1 68Ga-PSMA11 γ能譜圖

用半衰期法測(cè)定，以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，測(cè)量活度自然對(duì)數(shù)值lnA為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，擬合得直線方程lnA=5.119 3 -0.010 3t（圖2）。因此，λ=0.010 3，從而計(jì)算得到68Ga-PSMA11半衰期T1/2=0.693/λ=67.28 min。

圖 2 半衰期測(cè)定法時(shí)間-活度半對(duì)數(shù)圖

2.1.3 放射化學(xué)純度

用Radio-TLC法測(cè)定，68Ga-PSMA的Rf值在前沿，放射化學(xué)純度大于99%，且對(duì)照游離68Ga3+的Rf值在原點(diǎn)（圖3）。

圖 3 68Ga-PSMA11的放射化學(xué)純度Radio-TLC譜圖

用Radio-HPLC法測(cè)定，68Ga-PSMA11的放射化學(xué)純度大于99%（圖4）。

圖 4 68Ga-PSMA11的放射化學(xué)純度Radio-HPLC譜圖

2.1.4 放射性濃度

最終測(cè)得放射性濃度范圍為1 3 0 ～170 MBq/mL。

2.1.5 異常毒性檢查

昆明小鼠尾靜脈注射藥物后48 h均無異常或死亡顯像。

2.1.6 無菌檢查

注射液無真菌及一般細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.1.7 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

注射液檢測(cè)結(jié)果為陰性，無細(xì)菌內(nèi)毒素。

2.1.8 無菌過濾器完整性檢查

無菌過濾器加壓至0.2 MPa，隨時(shí)間延長(zhǎng)，壓力緩慢下降，表明過濾器膜結(jié)構(gòu)完整。

2.2 小動(dòng)物PET/CT成像研究

LNCaP模型小鼠尾靜脈注射68Ga-PSMA11后，于小動(dòng)物PET/CT上采集數(shù)據(jù)2 h，如圖5所示，除腎臟、膀胱生理性分布之外，腫瘤部位高度攝取。

圖 5 LNCaP模型小鼠68Ga-PSMA11 PET/CT顯像（箭頭所示為腫瘤所在位置）

通過軟件分析統(tǒng)計(jì)各組織器官每克組織的放射性計(jì)數(shù)（ID%/g），腫瘤部位放射性攝取隨注射后時(shí)間的推移逐步增多，約2 700 s時(shí)達(dá)到峰濃度（約7 ID%/g）并維持穩(wěn)定（圖6A）。腎臟對(duì)藥物生理性分布，其趨勢(shì)與腫瘤攝取類似，而膀胱生理性分布從570 s左右激增，且在3 900 s左右達(dá)到峰值并維持穩(wěn)定（圖6B）。心臟和血管在注射初期由于藥物濃度較高呈現(xiàn)高分布，而后隨著藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至全身逐步下降，其他組織器官（包括肝、脾、肺、肌肉、骨骼及腦等）均呈現(xiàn)較低放射性分布（圖6C）。

圖 6 68Ga-PSMA臟器動(dòng)態(tài)分布統(tǒng)計(jì)圖

由此可看出，68Ga-PSMA11除了在腎臟和膀胱生理性高分布外，在腫瘤部位特異性結(jié)合程度較好。

3 討 論

前列腺癌發(fā)病率逐年升高，對(duì)于前列腺癌的診斷和精準(zhǔn)治療越來越重要。前列腺癌細(xì)胞主要為上皮性惡性腫瘤細(xì)胞，其主要特點(diǎn)為增殖緩慢且糖代謝水平較低，因此，臨床上常用的18F-FDG正電子顯像劑對(duì)于前列腺癌的診斷效果并不理想，而11C-Choline半衰期過短，不利于常規(guī)顯像［9-10］。本科室在之前的研究中已制備單光子分子影像探針99mTc-HYNIC-Glu-Urea-A，用于SPECT/CT顯像［5-6］，并將其應(yīng)用于臨床獲得了較好的診斷結(jié)果，為臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供了依據(jù)，但其顯像速度較慢［7-8，11］。為快速獲得顯像結(jié)果、發(fā)現(xiàn)更小病灶，本科室制備了68Ga-PSMA11等前列腺癌PET/CT正電子分子影像探針。研究顯示，68Ga-PSMA11標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行，無需純化，非常適合臨床應(yīng)用。

本研究根據(jù)《放射性藥品鑒別法》、《正電子類放射性藥品質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》及本科室制定的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案對(duì)68Ga-PSMA11的質(zhì)量進(jìn)行控制［12］。主要檢查藥品性狀、pH值、放射性核純度、放射化學(xué)純度、放射性濃度、無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素。同時(shí)，取連續(xù)3批符合上述質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的藥物，進(jìn)行異常毒性檢查，確保該藥品無明顯不良反應(yīng)。

小動(dòng)物PET/CT動(dòng)態(tài)顯像結(jié)果顯示，PSMA陽性的LN CaP模型小鼠腫瘤高度攝取68Ga-PSMA11，心臟、脾、肺及腦等重要器官并無明顯攝取，且血液、肌肉等組織中的放射性分布也非常低，這完全符合分子影像探針的要求。同時(shí)PET/CT影像顯示腎臟和膀胱的放射性分布非常高（≥25 ID%/g），這表明68Ga-PSMA11主要經(jīng)過泌尿系統(tǒng)排泄。此外肝膽、腸道呈現(xiàn)低分布，這表明該化合物不經(jīng)過肝臟代謝，未進(jìn)行肝腸循環(huán)。動(dòng)態(tài)PET/CT顯像展示的時(shí)間-放射性曲線指示，注射后3 000～3 600 s為最佳顯像時(shí)間，這對(duì)具體的臨床應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義。

68Ga-PSMA11進(jìn)入體循環(huán)后，主要經(jīng)過腎臟排泄，同時(shí)在膀胱中蓄積，因此會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中后期膀胱放射性急劇升高的現(xiàn)象，且由于液體狀態(tài)的尿液流動(dòng)性較強(qiáng)，因此在進(jìn)行動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)分析時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)膀胱部位ID%/g的離散程度（方差）較大。由于泌尿系統(tǒng)的生理性放射性分布較高，前列腺部位的顯像結(jié)果會(huì)受一定程度的影響，這對(duì)于原發(fā)灶會(huì)造成一定的干擾（微小病灶）。針對(duì)這一現(xiàn)象，在后續(xù)研究中我們擬對(duì)藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，減少泌尿系統(tǒng)排泄或改變藥物排泄速率以錯(cuò)開腫瘤顯像最佳時(shí)間窗，從而獲得更好的顯像結(jié)果。

綜上所述，本研究自行制備的新型前列腺癌PET/CT分子影像探針68Ga-PSMA11標(biāo)記較為簡(jiǎn)單，放射化學(xué)純度高，能靶向前列腺癌細(xì)胞膜表面PSMA，可獲得較為特異性的顯像結(jié)果。