SIRT1/NF-κB通路在人參皂苷Rb1對高糖處理的H9C2細胞凋亡與炎癥反應作用的研究

王嘉睿 李蘇華 羅艷婷 黃卓山 彭隆 趙云躍 劉金來

【關鍵詞】 糖尿病心肌病;人參皂苷Rb1;沉默信息調節因子2相關酶1;細胞凋亡;

炎癥反應

Role of SIRT1/NF-κB pathway in the effect of ginsenoside Rb1 on apoptosis and inflammation of H9C2 cells treated with high glucose Wang Jiarui， Li Suhua， Luo Yanting， Huang Zhuoshan， Peng Long， Zhao Yunyue， Liu Jinlai. Department of Cardiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， 510630 Guangzhou， China

Corresponding author， Liu Jinlai， E-mail： liujinl@ hotmail. com

【Abstract】 Objective To investigate the role of silent information regulation 2 homolog 1 （SIRT1）/NF-κB pathway in the effect of ginsenoside Rb1 upon the apoptosis and inflammation of H9C2 cells treated with high glucose. ?Methods The H9C2 cells were cultured in high glucose medium （33 μmol/L） and co-treated with different concentrations of ginsenoside Rb1. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The concentrations of TNF-α and IL-6 in the cellular supernatant were measured by ELISA. The optimal treatment concentration of ginsenoside Rb1 for the high glucose-treated H9C2 cells was determined. SIRT1 gene was silenced by siRNA transfection. The expression levels of Bax， bcl-2， cleaved caspase-3， SIRT1 and NF-κB proteins were quantitatively detected by Western blot. The content of TNF-α and IL-6 in the cellular supernatant was measured by ELISA to determine whether ginsenoside Rb1 could alleviate the apoptosis and inflammation of H9C2 cells through SIRT1/NF-κB pathway. ?Results CCK8 assay demonstrated that the viability of H9C2 cells began to significantly decline when treated with 33 μmol/L glucose （P < 0.05）. The viability of H9C2 cells co-treated with 33 μmol/L glucose and 50μmol/L ginsenoside Rb1 had the highest cell viability （P < 0.05）. ELISA revealed that the concentrations of TNF-α （P < 0.05） and IL-6 （P < 0.05） were the lowest when the cells were co-treated with 50 μmol/L ginsenoside Rb1. The acetylation level of NF-κB significantly differed between the ginsenoside Rb1 and high glucose treatment groups （P < 0.05）. The expression levels of Bax/Bcl-2 and Acetyl-NF-κB/NF-κB did not significantly differ between the siRNA transfection plus ginsenoside Rb1 treatment group and siRNA transfection plus high glucose treatment groups （both P > 0.05）. The content of TNF-α and IL-6 did not significantly differ （both P > 0.05）. ?Conclusion Ginsenoside Rb1 can protect the H9C2 cells with high glucose treatment from apoptosis and inflammation via regulating the Sirt1/NF-κB pathway.

【Key words】 Diabetic cardiomyopathy;Ginsenoside Rb1;Silent information regulation 2 homolog 1;

Apoptosis;Inflammation

糖尿病心肌病（DCM）是一類無冠狀動脈疾病、高血壓病以及瓣膜疾病的糖尿病患者出現左室射血時間縮短，充盈末期心室壓力升高，左室壁僵硬，心收縮力減弱，以及等容舒張時間延長等一系列異常表現的心肌疾病[1-2]。其發病機制未被完全闡明，炎癥反應與細胞凋亡被認為是其重要的發病機制[3-4]。人參皂苷Rb1是人參的重要活性成分，在清除自由基、抗氧化、改善認知和延緩衰老方面發揮重要作用，有研究證實其可降低DCM大鼠心肌超微結構損傷并改善其血脂、血糖及心肌氧化應激水平[5-6]。另有研究發現人參皂苷 Rb1抗衰老的作用與上調沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）相關，人參皂苷 Rb1還可通過抑制NF-κBp65介導的氧化應激和炎癥反應延緩復制性內皮細胞衰老[7]。SIRT1是一種高度保守依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，研究表明在人卵巢顆粒細胞中通過激活SIRT1可以起到減輕凋亡與抗炎的作用[8-9]。本實驗擬觀察人參皂苷Rb1對高糖處理下大鼠胚胎心源性干細胞H9C2細胞的最佳保護濃度，并從SIRT1/NF-κB通路探討人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞凋亡與炎癥反應作用的機制。

材料與方法

一、材 料

H9C2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。細胞培養用DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司。人參皂苷Rb1購自成都普菲得生物技術有限公司。 SIRT1 siRNA，陰性對照序列購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。Lipofetamine@ RNA-iMaX與Opti-MEM I購自Thermo-Fisher公司。CCK-8試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司。TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。細胞裂解液購自新海基因公司，蛋白酶抑制劑購自MedChemExpress，HRP標記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自博士德生物。兔抗大鼠核因子-κB（NF-κB）、acetylated-NF-κB、cleaved caspase-3、GAPDH一抗、小鼠抗大鼠SIRT1一抗購自Cell Signaling Technology。兔抗大鼠Bax、Bcl-2一抗購自博士德生物。

二、方 法

1. 細胞培養及分組

H9C2細胞培養于含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養基中。細胞培養至80%融合后，消化并細胞計數按8×105/孔的數量傳代至6孔板中。在探討人參皂苷Rb1對H9C2細胞在高糖環境下起保護的最佳濃度時：將細胞分為對照組、20 μmol/L Rb1組、50 μmol/L Rb1組、100 μmol/L

Rb1組、120 μmol/L Rb1組、200 μmol/L Rb1組，將不同濃度的藥物加入細胞培養液中培養48 h。在探討人參皂苷Rb1是否通過SIRT1/ NF-κB通路減輕H9C2細胞凋亡與炎癥反應機制時，分為6組：正常糖（5.5 mmol/L）組、高糖（33 mmol/L）組、高糖+人參皂苷Rb1組、高糖+DMSO組、高糖+SIRT1 siRNA組、高糖+SIRT1 siRNA組+Rb1組，將不同處理加入細胞培養液中培養48 h。

2. RNA干擾

SIRT1 siRNA序列（正義鏈為5’-GGCAGUU-

AAUGAAGCUAUATT-3’，反義鏈為5’-UAUAGCU-UCAUUAACUGCCTT-3’）、陰性對照序列（正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）用DEPC水配成20 μmol/L的濃度分裝保存于-20℃。轉染前1 d，2 ml無血清無抗生素培養基接種5×105個H9C2細胞，轉染時細胞密度60%。每孔用50 μl Opti-MEMI培養基稀釋3 μl Lipofectamine@RNA-iMax轉染試劑，另每孔用50 μl Opti-MEMI培養基稀釋

5 μl siRNA，各混勻后室溫放置5 min，將稀釋好的siRNA及轉染試劑溶液混合，室溫靜置10～15 min，將混合液加入6孔板中，充分混勻，置入37℃，5%CO2培養箱培養6 h后，更換新鮮培養基，再轉移入培養箱繼續培養24 h。

3. 細胞活力檢測

將H9C2細胞接種于96孔板中，每孔3 000個細胞，每個處理因素設3個復孔。細胞貼壁后進行處理，探索培養基糖濃度時設置5個組：對照組、33 μmol/L葡萄糖組、44 μmol/L葡萄糖組、55 μmol/L葡萄糖組、5.5 μmol/L葡萄糖+27.5 μmol/L甘露醇組（Mannitol）。設置7個組：調零組、對照組、高糖組、高糖+20 μmol/L Rb1組、高糖+50 μmol/L Rb1組、高糖+100 μmol/L Rb1組、高糖+200 μmol/L Rb1組。作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，放入37℃溫箱避光培養2.5 h。最后用酶標儀讀取各孔在450 nm的吸光度值（OD）。 細胞存活率計算公式=（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）×100%。

4.蛋白免疫印跡法

細胞蛋白提取方法按照南京凱基生物有限公司全蛋白提取試劑盒說明書執行。隨后按上海生工生物工程技術公司BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白量。經BCA定量后，取30 μg總蛋白進行

SDS-PAGE電泳，然后轉移到PVDF膜上。用5%BSA室溫封閉1 h后，加入相應抗體（SIRT1 1∶3 000，NF-κB 1∶3 000，acetylated-NF-κB 1∶1 000，cleaved-caspased 1∶1 000， Bax 1∶3 000、Bcl-2 1∶3 000），4℃搖床過夜孵育洗膜;然后用二抗室溫孵育1 h，在暗室中用增強化學發光檢測試劑顯色，拍片晾干，計算機掃描，采用Image J軟件分析蛋白條帶。目的蛋白相對表達量=目的蛋白OD/內參照。

5. TNF-α、IL-6含量檢測

細胞培養液上清液中TNF-α、IL-6的含量按照ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書步驟檢測。

三、統計學處理

采用Graphpad Prism 7.0.4進行分析，計量資料以表示，組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同葡萄糖濃度對H9C2細胞活性的影響

用CCK8法測定不同糖濃度高糖培養基里H9C2細胞的活性，得出33 μmol/L及以上糖濃度處理下的H9C2細胞已經有細胞活性的降低，并與對照組比較差異有統計學意義（F=5.123， P <

0.05;33 μmol/L組 vs.對照組P = 0.008，44 μmol/L

vs.對照組P = 0.010，55 μmol/L組 vs. 對照組P = 0.004），見圖1A，故選定33 μmol/L為本次實驗的處理濃度。

二、不同濃度人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞活性的影響

用CCK8法測定33 μmol/L高糖培養基里不同人參皂苷Rb1濃度處理的細胞活性，得出50 μmol/L的人參皂苷Rb1與高糖共處理下的細胞活性最高，并與高糖組比較差異有統計學意義（F = 57.33， P < 0.05;高糖組vs. 對照組P < 0.001，高糖組vs.高糖+50 μmol/L Rb1組P = 0.004），見圖1B。

三、不同濃度人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞分泌TNF-α、IL-6水平的影響

ELISA測定細胞上清液中的TNF-α與IL-6分泌蛋白量，可見人參皂苷Rb1 濃度為50 μmol/L時候的TNF-α與IL-6在各個濃度組中最低，分別為（386.1±19.42） pg/ml與（23.05±1.29） pg/ml，

與高糖組比較差異均有統計學意義（TNF-α：F = 16.42， P < 0.05，高糖組vs.對照組P < 0.001，高糖組vs.高糖+50 μmol/L Rb1組P < 0.001;IL-6：F = 8.375，P < 0.05，高糖組vs.對照組P = 0.018，高糖組vs.高糖+50 μmol/L Rb1組P = 0.008），見圖2。

四、不同濃度人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase 3的含量的影響

蛋白免疫印跡法結果顯示，50 μmol/L的人參皂苷Rb1處理時Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3的含量與高糖組比較差異均有統計學上意義（Bax/Bcl-2： F = 14.17， P < 0.05，高糖組vs.對照組P = 0.047，高糖組vs.高糖+50 μmol/L Rb1組P < 0.001。cleaved caspase-3： F = 15.47， P < 0.05;高糖組vs.對照組P = 0.001，高糖組vs.高糖+50 μmol/L Rb1組P = 0.012），較其他濃度平均值最低，見圖3。綜上，故選擇50 μmol/L作為后續高糖狀態下人參皂苷Rb1干預的濃度。

五、 SIRT1的siRNA干擾后人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞的SIRT1、Bax、Bcl-2、NF-κB，Acetyl-NF-κB蛋白表達量影響

與SIRT1 siRNA組相比，SIRT1 siRNA+Rb1組

SIRT1（F = 700， P < 0.05;SIRT1 siRNA組vs. SIRT1 siRNA+Rb1組P = 0.107）、Bax/Bcl-2（F = 187， P < 0.05;SIRT1 siRNA組vs. SIRT1 siRNA

+Rb1組P = 0.867）、acetyl-NF-κB/NF-κB（F = 458， P < 0.05;SIRT1 siRNA組vs. SIRT1 siRNA+Rb1組P = 0.079）蛋白表達水平相當，高糖 +Rb1組SIRT1表達量更高（高糖+Rb1組vs. SIRT1 siRNA組P < 0.001），Bax/Bcl-2與Acetyl-NF-κB/NF-κB更低（P均< 0.001），見圖4。

六、SIRT1的siRNA干擾后人參皂苷Rb1對高糖處理下H9C2細胞上清液TNF-α，IL-6濃度測定

SIRT1 siRNA組與SIRT1 siRNA+Rb1組TNF-α（F = 208， P < 0.05;SIRT1 siRNA組vs. SIRT1

siRNA+Rb1組P = 0.274）、IL-6（F = 61.68，P < 0.05; SIRT1 siRNA組vs SIRT1 siRNA+Rb1組P = 0.9677）濃度比較差異均無統計學意義，高糖+Rb1組TNF-α、IL-6濃度則低于SIRT1 siRNA組（P均< 0.001），見圖5。

討 論

本研究顯示，高糖組 H9C2 心肌細胞的活性下降，而 50 μmol/L的人參皂苷Rb1顯著增加了高糖培養的 H9C2 心肌細胞的活性，提示人參皂苷Rb1對 H9C2 心肌細胞的活力有保護作用。

SIRT1在原核和真核細胞中都能調節重要的代謝通道，與細胞存活、衰老、增殖、凋亡、DNA修復、細胞代謝與能量限制等重要的生命活動相關[10]。心肌細胞凋亡過度是糖尿病心肌病發生的重要病理學變化，受到多種凋亡蛋白的調控[3]。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者，其在正常情況下以無活性的酶原存在，而它的活化需要水解為p12與p17兩個活性片段以促進細胞凋亡的發生[11]。Bax是Bcl-2蛋白家族的成員，其表達上調后發揮促凋亡作用，而在各種凋亡刺激下，Bcl-2 通過抑制線粒體細胞色素C的釋放而發揮存活功能，二者的比值可以一定程度上表示細胞的凋亡水平[12-13]。本研究構建了心肌細胞在高糖處理下模型，發現高糖處理中心肌細胞表達cleaved caspase-3。Bax/Bcl-2顯著升高，而以50 μmol/L的人參皂苷Rb1處理后可顯著降低上述凋亡相關蛋白的表達，起到減輕凋亡的作用。通過siRNA干擾技術下調SIRT1表達后發現，下調SIRT1的心肌細胞在高糖環境中表達的Bax/Bcl-2比值顯著升高，且加用人參皂苷Rb1的處理后無顯著差異，SIRT1的下調抵消了人參皂苷Rb1抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡的作用。

心肌細胞過度凋亡之外，炎癥也是糖尿病心肌病發病的重要機制，TNF-α、IL-6等細胞因子可以促進類似于瀑布式的炎癥反應，造成心肌組織損傷[14]。本研究表明，高糖處理后心肌細胞分泌的TNF-α、IL-6水平顯著升高，而加用50 μmol/L

人參皂苷Rb1處理后可以顯著降低上清細胞分泌的TNF-α、IL-6，減少炎癥因子的釋放。下調SIRT1后可抵消人參皂苷Rb1使TNF-α、IL-6下降的作用，人參皂苷Rb1可通過上調SIRT1降低TNF-α、IL-6的分泌。

NF-κB是一個廣泛存在的同源或異源二聚體轉錄因子，它可以調控細胞存活、分化與增殖，參與機體防御、組織損傷、應激及炎癥過程中相關基因表達調控[15]。SIRT1的激活能夠對NF-κBp65的K310與組蛋白3的K9發揮去乙酰化作用，導致NF-κBp65與DNA之間的連接減少，繼而下調還原型輔酶Ⅱ的氧化應激亞單位（NOX1和NOX2）的轉錄，實現減輕心肌肥厚和下調氧化應激[16]。本研究顯示在高糖環境下的心肌細胞加用50 μmol/L人參皂苷Rb1處理之后顯著下調了NF-κB的乙酰化水平（acetyl-NF-κB/NF-κB），而用siRNA下調SIRT1表達后NF-κB的乙酰化水平顯著升高，再加用人參皂苷Rb1對NF-κB的乙酰化水平沒有顯著改變，表明NF-κB的乙酰化以及其下游反應可由SIRT1介導。

綜上所述，人參皂苷Rb1可通過SIRT1/NF-κB通路減輕細胞凋亡與炎癥反應，推測其對糖尿病心肌病有保護作用。作用于SIRT1/NF-κB通路的藥物可能是臨床上糖尿病心肌病的治療方法之一。

參 考 文 獻

[1] Rubler S， Dlugash J， Yuceoglu YZ， Kumral T， Branwood AW， Grishman A. New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis. Am J Cardiol， 1972， 30（6）： 595-602.

[2] Shapiro LM. Echocardiographic features of impaired ventricular function in diabetes mellitus. Br Heart J， 1982， 47（5）： 439-444.

[3] Bugger H， Abel ED. Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy. Diabetologia， 2014， 57（4）： 660-671.

[4] 王嘉睿，吳永祥，劉金來. AMPK/SIRT1/NF-κB通路在糖尿病心肌病中的作用. 新醫學， 2017， 48（10）： 677-682.

[5] Cheng Y， Shen LH， Zhang JT. Anti-amnestic and anti-aging effects of ginsenoside Rg1 and Rb1 and its mechanism of action. Acta Pharmacol Sin， 2005， 26（2）： 143-149.

[6] 谷金寧， 牛俊， 皮子鳳， 越皓，吳綏生，劉淑瑩. 尿液代謝組學方法研究人參總皂苷治療糖尿病心肌病大鼠作用機制. 分析化學， 2013， 41（3） ： 371-376.

[7] 周彬，吳琳，凌葉盛，余舒杰，劉定輝，柯世業，劉勇，郝寶順，錢孝賢.人參皂苷Rb1通過抑制NF-κB p65介導的炎癥和氧化應激改善內皮細胞復制性衰老. 中山大學學報（醫學科學版），2018，39（6）：835-843.

[8] Finkel T， Deng CX， Mostoslavsky R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature， 2009， 460（7255）：587-591.

[9] Han Y ， Luo H ， Wang H ， Cai J， Zhang Y. SIRT1 induces resistance to apoptosis in human granulosa cells by activating the ERK pathway and inhibiting NF-κB signaling with anti-inflammatory functions. Apoptosis， 2017，22（10）：1260-1272.

[10] Carafa V， Rotili D， Forgione M， Cuomo F， Serretiello E， Hailu GS， Jarho E， Lahtela-Kakkonen M， Mai A， Altucci L. Sirtuin functions and modulation： from chemistry to the clinic. Clin Epigenetic， 2016，8：61.

[11] Nicholson DW， Ali A， Thornberry NA， Vaillancourt JP， Ding CK， Gallant M， Gareau Y， Griffin PR， Labelle M， Lazebnik YA. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature，1995，376（6535）：37-43.

[12] Wei MC， Zong WX， Cheng EH， Lindsten T， Panoutsakopoulou V， Ross AJ， Roth KA， MacGregor GR， Thompson CB， Korsme-yer SJ. Proapoptotic BAX and BAK： a requisite gateway to

mitochondrial dysfunction and death. Science，2001，292 （5517）：727-730.

[13] Murphy KM， Ranganathan V， Farnsworth ML，Kavallaris M， Lock RB. Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. Cell Death Differ，2000，7（1）：102-111.

[14] Lin L， Wu XD， Davey AK， Wang J.The anti-inflammatory effect of baicalin on hypoxia/reoxygenation and TNF-αinduced injury in cultural rat cardiomyocytes. Phytother Res， 2010， 24（3）：429-437.

[15] Zhang Q， Lenardo MJ， Baltimore D. 30 years of NF-κB： a blos-soming of relevance to human pathobiology. Cell， 2017， 168（1-2）：37-57.

[16] Bagul PK， Deepthi N， Sultana R， Banerjee SK. Resveratrol ameliorates cardiac oxidative stress in diabetes through deacety-lation of NFκB-p65 and histone 3. J Nutr Biochem， 2015， 26（11）： 1298-1307.

（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）