液相色譜校準曲線法檢測藥物殘留時不確定度的評估與分析

方強　丁成　黃芳　章雪明

[摘要]本文從檢測全過程及儀器定量原理的角度出發，評估了液相色譜法測定鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留時的不確定度。研究結果表明，諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星3類參數校正點相對不確定度分別占合成相對標準不確定度的5.6%、34.2%、1.7%;藥物殘留含量計算值相對不確定度分別占合成相對不確定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相對不確定度分別占合成相對不確定度的89.4%、42.9%、80.3%。

[關鍵詞]液相色譜校準曲線法;檢測藥物殘留;不確定度

中圖分類號：TS207

文獻標識碼：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190408

藥物殘留檢驗系符合性檢驗，當測試結果處于規定指標臨界值附近時，測量不確定度對判斷結果符合性會產生影響。2016年1月1日實施的《檢驗檢測機構資質認定評審準則》明確提出了不確定度的要求，準確評估測量不確定度對藥物殘留檢驗檢測機構具有重要意義。

藥物殘留的檢驗檢測通常具有較為復雜的前處理過程，進而使檢驗檢測的結果出現誤差。規范相關的檢驗檢測標準雖然會給出回收率允許的參考范圍，但是一般都未要求對范圍內的非100%回收進行校正，誤差就轉化為測量不確定度。

本文從一般殘留試驗全過程及儀器定量原理的角度出發，參考汪輝等藥物殘留不確定度評估方法，解析了液相色譜校準曲線法檢測藥物殘留時不確定度的來源，并以鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留為例，按GUM法評估了測量不確定度，為同類型的藥物殘留檢驗提供了一定的參考作用。

1藥物殘留檢測一般過程

藥物殘留檢測一般過程見圖1。

2測量模型和不確定度來源

2.1測量模型

試樣中藥物殘留計算公式：

（1）標準儲備液濃度

（2）高濃度標準使用液濃度

（3）低濃度標準使用液濃度

由公式（1）和公式（2）可得校準曲線高濃度的3個點：

由公式（11）和公式（3）可得低濃度的3個點：

（4）校準曲線線性回歸方程

（5）試樣測定濃度

（6）試樣含量計算值

（7）陽性添加樣品添加含量

（8）回收率

（9）試樣真實含量

式中：C儲為標準儲備液濃度，μg/mL;m標為標準品稱樣量，g;P為標準品的純度;MW為純物質分子量;MW2為帶其他基團后的分子量;V容1為標準儲備液定容體積，mL;e使為高濃度標準使用液的濃度，μg/mL;V移1為移取標準儲備液的體積，mL;V容2為高濃度標準使用液的定容體積，mL;c'使為低濃度標準使用液濃度，μg/mL;V'移1為移取高濃度使用液配制低濃度使用的體積，mL;V'容2為低濃度標準使用液的定容體積，mL;C點為校準曲線各點的濃度，ng/mL;V移2為校準曲線各點移取的標準使用液的體積，μL;V容3為校準曲線各點的定容體積，mL;y為峰面積;a為校正曲線的截距;b為斜率;V容4為測定液的定容體積，mL;V移了為陽性添加樣品加標體積;X因為陽性樣品添加含量;X為試樣藥物殘留的含量;fp為平均回收率和期望值100%偏差的校正因子;fg為校正曲線配制過程中校正點誤差校正因子。

2.2不確定度來源

由公式（11）可知，不確定度的來源包括含量計算值的不確定度、回收率的不確定度和校正點的不確定度。

3鱸魚中3種喹諾酮類藥物殘留測定時不確定度評定

3.1實驗

3.1.1材料與試劑

試驗樣品為鱸魚;諾氟沙星（Nor）、鹽酸環丙沙星（Cip）、恩諾沙星（Enr）標準儲備液均由Dr.Ehrenstorfer公司的固體標準品配制而成;鹽酸、無水硫酸鈉（經650C灼燒烘干）為分析純;乙腈、正已烷、磷酸、三乙胺為色譜純試劑;酸化乙腈（乙腈：鹽酸=250：1）;0.34%磷酸水溶液（經三乙胺調節pH值至2.4）;試驗用水均符合GB/T6682-2008131-級水的要求。

3.1.2儀器與設備

e2695液相色譜儀、2489熒光檢測器：美國Waters公司;BSA2202S-CW百分之一電子天平、十萬分之一電子天平：德國賽多利斯公司;XcelVap自動濃縮工作站：美國Horizon公司;0.2μmx13mmNYL慮頭：英國Whatman公司。

3.1.3標準儲備液及校正曲線配制

分別稱取0.00503g的Nor、0.00582g的Cip.0.00504g的Enr固體標準物質于3個50mL容量瓶中，用2%甲酸一甲醇溶液溶解定容，濃度均為100μg/mL。分別吸取Nor和Enr標準儲備液各5mL、Cip標準儲備液1mL于50mL容量瓶中，用流動相定容得Nor和Enr濃度為10μg/mL、Cip濃度為2μg/mL的混合標準工作液;吸取該混合標準工作液200μL于5mL指形管中，用1mL移液槍分2次吸取900μL流動相定容，得Nor和Enr濃度為1.0μg/mL.Cip濃度為0.20μg/mL的混合標準工作液。

分別移取上述濃度的混合標準工作液各25μL、50μL、100μL于6個2mL進樣瓶中，用1mL移液槍移取流動相定容至1mL，得Nor和Enr濃度為25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，Cip濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的校準溶液系列。

所用容量瓶為A級硼硅玻璃。流動相的水溫為21～25%C。3種喹諾酮類藥物校正曲線回歸方程如下：（1）Nor：y=145596x+2638353，r=0.999899，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=145596，截距a=2638353。（2）Enr：y=220610x+9215728，r=0.999878，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=220610，截距a=9215728。（3）Cip：y=121276x+398669，r=0.999855，其中y為峰面積，x為濃度，斜率b=121276，截距a=398669。

3.1.4樣品處理及測定

陰性對照樣品和陽性添加樣品各7個重復，陽性添加樣品加人0.15mL的Nor和Enr濃度為1.0μg/mL、Cip濃度為0.20μg/mL的混合標準工作液作為陽性添加試驗。

（1）前處理。稱取5g樣品，置于50mL離心管中，加入6g無水硫酸鈉，25mL酸化乙腈，振搖10min，8000r/min離心5min，取上清液，氮吹至干，1mL流動相定容，3mL正已烷抽脂，下層液過濾頭待測。

（2）測定。本次測定采用校正曲線法定量，流動相為乙腈和0.34%磷酸一水溶液（15：85）的混合溶液。色譜柱：WatersXBridgeC184.6μmx250mm;流速：1.0mL/min;柱溫：35%C;進樣量：20μL;進樣時間：30min;激發波長：280nm;發射波長：450nm。

（3）數據。方法偏差試驗結果見表1。

（4）數據檢驗。采用Grubbs檢驗法對表1數據進行檢驗，經檢驗，數據均無異常。

3.2不確定度評定

3.2.1校正點的相對標準不確定度

本文所用校正曲線的6個點中，低濃度3個點較高濃度3個點多一步稀釋，故低濃度點的不確定度應大于高濃度點，本文取低濃度點中不確定度最大點作為校正點的不確定度。根據公式（5）可得校正點的相對標準不確定度：

因V'容2和V。容3的定容實際為一個移液過程，V移1和V稱2引人的不確定度可包含在V容2和V容3中，則：

本文所用Cip標準品帶鹽酸基團，故應計算MW引人的不確定度，其余標準品為純物質，不需要考慮（取均勻分布k=√3）。查元素周期表（2005年）計算后得：u（MW|）2=3.7573x10-6

標準品稱量引入的相對標準不確定度u2（m標）見表2。十萬之一天平稱量5g以下時允差為+0.5e，本文采用減量法稱量標準品，取三角分布，故：

式中：m標表示各標準品稱樣量，go標準品純度P引入的相對標準定度：

查標準物質證書：Py;99.1%，Uo=1.0%（k=2）;Pem=99.1%，Up=1.0%（k=2）;Pcar=94.0%，Ucn=1.0%（k=2）。則有Nor：u（P）=0.5，u（P）=2.546x10～;Enr：u（P）=0.5，12（P）=2.551x10～;Cip：.u（P）=0.5，u（P）=2.829x10～。

構成體積V不確定度u（V）主要分量有3個：量器示值偏差引人的不確定度u（AV示），配制溶液時溶液溫度偏離標準溫度引人的工標體積差不確定度u（AV工），使用溶液時的液溫偏離配制溶液時的液溫引人的溫變體積差不確定度u（AV;溫）。本試驗室有中央控溫系統，且在同一天完成，查當日的溫度監控記錄，溫度變化為21～25%C。

u2（V）=u2（AV示）+u2（AV⊥）+u？（AV溫）（21）（1）量器示值偏差的不確定度u（AV示）。查JJG646-2006/41和JJG196-200651得到所用量器的容量V，允差，取三角分布，k=√6，示值偏差引人的標準不確定度見表3。

（2）工標體積差的不確定度Iu（（△V工）。由于水、甲醇和乙腈的密度隨溫度變化呈非線性，用體積膨脹法計算溫度變動導致甲醇溶液和水-乙腈混合溶液（流動相）的體積變化是不合適的。根據密度定義式推導出體積變化算式，再用密度修正值代替密度值便可進行準確計算。其中，乙腈-水的密度隨溫度變化表沒有查到，參考甲醇-水的密度變化表。K（t）根據JJG646-200641和JJG196-200651計算公式得到。容量瓶為硅硼玻璃，取三角分布。根據使用的量器和液體種類的不同，代人公式計算后，工標體積誤差不確定度見表4。

（3）溫變體積誤差的不確定度見表5。

（4）體積V不確定度u（V）合成。根據定容或移液的體積、量器的材質以及液體種類計算，結果見表6。

（5）計算濃度和期望濃度誤差引人的不確定度。試驗過程中標準曲線的計算濃度和期望濃度是有差異的，但為了方便計算、本文直接以期望濃度賦予各校正點濃度，根據經驗該行為引人的相對標準不確定度在最低濃度點最大，故代人公式計算后（取均勻分布），數據見表7。

3.2.2藥物殘留含量計算值引入的相對標準不確定度

藥物殘留含量計算值引入的相對標準不確定度：

測定濃度引入的相對標準不確定度：

式中：S成為校正曲線的殘余偏差;p為試驗重復次數;n;為校正曲線的點數;文校為校正曲線各濃度點數值的平均值;x;為校正曲線各點的濃度值;y;為校正曲線個點的峰面積;c為測定濃度的平均值。

將數據代人公式，得Nor：S殘=8.712x10';Enr：s殘=1.448x10*;Cip：sa=5.166x10'。Nor：u（c測）=3.616，un2（C測）=0.02958;Enr：u（c測）=3.877，Urel（C測）=0.02514;Cip：u（c測）=2.602，uu（c測）=0.1201。

（2）u2（Vw4）的計算。V容4定容實際為一個移液過程，且3類化合物的不確定度都相同，故u2（V容4）=1.757x10～。

（3）稱量試樣時引人的不確定度：

式中：m樣為稱樣量，m樣為陰性對照樣品和陽性添加樣品稱樣量的平均值，為5.00g。百分之一天平允差為+0.5e，取三角分布，則：u2（m樣）=（0.05+√6）2=8.333x10+，u2（m程）=1.67x10-

（4）儀器引人的相對標準不確定度。液相色譜重復定量測定RSD≤3%（本文取3%），根據A類標準不確定度的計算公式可得儀器引人的相對標準不確定度：u2（f儀器）=（0.03+√6）2=1.5x10-2

（5）u2（X計）的合成。Nor：u2（X計）=1.05x10*;Enr：u（X計）=8.16x10*;Gip：u（X）=1.46x10-2。

3.2.3回收率引入的相對不確定度

回收率引人的相對不確定度：

（1）回收率與期望值差異引人的相對標準不確定度。對各參數的回收率進行顯著性檢驗，其中：

式中：S回收率為回收率的標準偏差，R為回收率的平均值，R。為回收率期望值（R.=100%），t為置信因子。結果表明，Nor、Cip的回收率與期望值存在顯著性差異，即引人了不確定度;Enr不存在顯著性差異，即引人的不確定度可忽略。計算數據取均勻分布，結果見表8。

（2）陰性和陽性對照樣品在回收率計算中引人的相對標準不確定度Uuea（X陰）和un2（X陽）。陰性對照樣品參數含量值接近0，本文認為其不確定度為儀器的不確定度，2（Xp）+u2（f儀器）=1.5x10+。陽性添加樣品uoa（Xp）與un（X+）是相同的，Nor：u2（Xq）=1.05x10～;Enr：品（X陽）=8.16x10*;Cip：疏（X陽）=1.46x10～。

（3）添加含量引入的相對標準不確定度。根據公式（9）可得：

（4）回收率重復性引人的相對不確定度。將表8中的R、S回收率代人公式：

3.2.4相對標準不確定度的合成

4結論

（1）Nor、Enr、Cip（以下數據如無特殊說明均按此順序排列）3個參數校正點相對不確定度分別占合成相對標準不確定度的5.6%、34.2%、1.7%;藥物殘留含量計算值相對不確定度分別占合成相對不確定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相對不確定度分別占合成相對不確定度的89.4%、42.9%、80.3%。因標準物質帶有非目標的基團而引人的相對標準不確定度較小，可忽略不計，因移液、定容等體積因素引入的相對不確定度占校正點相對不確定度分別為96.7%、96.7%、86.9%，其中因V容3-Iml，引人的不確定度占該類相對不確定度的92%、92%、91.2%，故在校正點配制過程因移液、定容等體積因素引人的相對不確定度中可僅考慮V容3-Iml.引人的不確定度8-1藥物殘留含量的計算值引入的相對不確定度中的22（C測）和u2（f儀器）之和分別占該類相對不確定度的97.6%、95.8%、99.8%，故在22（X計）的計算過程中可僅考慮這兩類的不確定度。回收率引人的相對不確定度Nor和Cip分別是Enr的6倍和23倍，這一問題主要是由于Nor和Cip的回收率均值與期望值存在顯著性差異，該差異引人的相對不確定占Nor和Cip回收率相對不確定度91.2%、75.3%。3個參數的合成相對標準不確定度排序為Cip>Nor>Enr，且彼此之間差距明顯。藥物殘留含量測定過程中相對不確定度大小主要是由樣品中殘留藥物濃度大小和實際檢出含量和真實含量之間的差異決定的，后者無法量化，故引人加標回收來解決這一問題。

（2）由不確定度評定過程可知，不確定度大小與試驗流程嚴格對應，試驗流程所涉及的步驟越多則引人的不確定度越多，為確保檢測數據的準確性，整個試驗流程應盡可能簡化。

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