蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對腦中動脈阻塞—再灌注損傷模型大鼠神經功能損傷的改善作用及機制研究

烏蘭圖雅 特格喜白音 玉蘭 圖雅

中圖分類號 R285.5；R29 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0652-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.15

摘 要 目的：研究蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠神經功能損傷的改善作用及機制。方法：將80只大鼠隨機分為假手術組、模型組、新黑蘇嘎烏日勒組（540 mg/kg）、化學藥陽性對照組（尼莫地平片，16.12 mg/kg）、中藥陽性對照組（銀杏葉片，5.18 mg/kg），每組16只；除假手術組外，其余各組大鼠采用Zea-Longa線栓法復制腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型；造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，假手術組和模型組灌胃等量蒸餾水，連續灌胃14 d。末次給藥1 h后，對各組大鼠進行神經功能損傷評分；采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑法計算各組大鼠腦梗死率、腦含水率及腦指數；蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠腦組織海馬區神經元病理學變化；免疫組化染色法檢測各組大鼠腦前額葉腦源性神經營養因子（BDNF）和神經生長因子（NGF）蛋白表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經功能損傷評分、腦梗死率、腦含水率、腦指數和BDNF、NGF蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），腦組織海馬區神經元細胞排列松散，形狀不規則，部分胞體皺縮，胞漿內尼氏小體減少，核仁消失。與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學藥陽性對照組、中藥陽性對照組大鼠神經功能損傷評分、腦梗死率、腦含水率、腦指數均顯著降低（P<0.05或P<0.01），腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），腦組織海馬區神經元細胞排列整齊緊密，細胞核圓整，細胞質染色均勻。結論：蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠神經功能損傷具有一定的改善作用，其作用機制可能與增加BDNF及NGF蛋白的表達有關。

關鍵詞 蒙藥；新黑蘇嘎烏日勒；腦中動脈阻塞-再灌注損傷；大鼠；機制

Study on Improvement Effect of Neurological Impairment and Mechanism of Mongolian Medicine New Hesugawurile on Middle Cerebral Artery Occlusion-reperfusion Injury Model Rats

Wulantuya1，Tegexibaiyin2，Yulan3，Tuya4（1.Dept. of Five Traditional Therapies and Rehabilitation， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；2.Innovative Mongolian Medicine Engineering Research Center， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；3.Dept. of Five Traditional Therapies and Encephalopathy， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China；4.Dept. of Gastroenterology， Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect of neurological impairment and mechanism of Mongolian medicine New Hesugawurile on middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury model rats. METHODS： Totally 80 rats were randomly divided into sham operation group， model group， New Hesugawurile group （540 mg/kg）， chemical drug positive control group （Nimodipine tablet， 16.12 mg/kg） and TCM positive control group （Ginkgo biloba leaves tablet， 5.18 mg/kg）， with 16 rats in each group. Except for sham operation group， middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury model was estbalished by Zea-Longa suture method in other groups. After modeling， administration group was given relevant medicine intragastrically， while sham operation group and model group were given same volume of distilled water intragastrically， for consecutive 14 d. 1 h after last medication， neurological impairment score was conducted in each group. Cerebral infarction rate， cerebral water content and cerebral indexes were calculated by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride method. The pathological changes of cerebral hippocampal neurons of rats were observed by HE staining. The expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） and nerve growth factor （NGF） protein in prefrontal lobe of rats were observed by immunohistochemical staining. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological impairment score， cerebral infarction rate， cerebral water content， cerebral index， the expression of BDNF and NGF protein were significantly rised in model group （P<0.01）； the cerebral hippocampus neurons were loosely arranged， irregular in shape， while some of them shrank， nissl bodies in the cytoplasm decreased and the nucleoli disappeared. Compared with model group， the neurological impairment score， cerebral infarction rate， cerebral water content and cerebral indexes were decreased significantly in New Hesugawurile group， chemical drug positive control group and TCM positive control group （P<0.05 or P<0.01）， and the expression of BDNF and NGF protein in prefrontal lobe of rats were rised significantly （P<0.05 or P<0.01）. The cerebral hippocampus neurons were arranged tightly， with round nucleus and uniform cytoplasmic staining. CONCLUSIONS： Mongolian medicine New Hesugawurile can improve the neurological impairment of cerebral artery occlusion-reperfusion injury model rats， the mechanism of which may be associated with the expression up-regulation of BDNF and NGF protein.

KEYWORDS Mongolian medicine； New Hesugawurile； Middle artery occlusion-reperfusion injury； Rats； Mechanism

缺血性腦中風是由于腦組織局部供血動脈血流灌注減少或血流完全中斷、停止供血供氧，而引起的偏癱和意識障礙[1]。我國傳統蒙醫藥在治療缺血性腦中風上具有豐富的臨床經驗并取得了良好的治療效果，蒙藥新黑蘇嘎烏日勒是內蒙古自治區國際蒙醫醫院（以下簡稱“我院”）烏蘭圖雅主任醫師根據《蒙醫金貴》[2]經典組方黑蘇嘎-25味丸制成的治療缺血性腦中風的有效方劑，主要成分為石決明、麝香、紅花、訶子、黑云香等，具有活血化瘀、清熱解毒、疏通白脈、祛黃水的作用，可用于治療缺血性腦中風患者的半身不遂、面部歪斜、手足麻木、言語不清等。筆者在前期研究中發現[3]，新黑蘇嘎烏日勒在臨床上治療缺血性腦中風具有良好的效果。由于其作用機制尚不明確，缺少實驗研究基礎。因此，筆者采用改良Zea-Longa線栓法復制腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠，探究蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對模型大鼠神經功能損傷的改善作用及機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

MGC-350電熱恒溫培養箱（蘇州澳爾利烘箱電熱設備制造有限公司）；ZA120R4電子天平（上海贊維衡器有限公司）；BX53光電顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；BPH-600數字式pH計（上海日島科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

新黑蘇嘎烏日勒（內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心，批號：20160345，規格：60丸/袋）；尼莫地平片（拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ33125，規格：30 mg/片）；銀杏葉片（湖南華納大藥廠股份有限公司，批號：170210，規格：19.2 mg/片）；水合氯醛（北京市旭東化工廠，批號20000530）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：F7038619）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，北京索萊寶科技有限公司，批號：5091034）；兔抗鼠免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（福建邁新生物技術開發有限公司，批號：1502289706）；無水乙醇（批號：20140823）、二甲苯（批號：20150706）均購自沈陽市新化試劑廠；多聚甲醛（批號：F20161203）、枸櫞酸鈉（批號：20120709）、枸櫞酸（批號：20130507）均購自國藥集團化學試劑有限公司；大鼠腦源性神經營養因子（BDNF）試劑盒（批號：20161203）、神經生長因子（NGF）試劑盒（批號：20161115）均購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠80只，♀，體質量190～220 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002。購入后分籠飼養，自由飲水，飼養環境溫度為22～25 ℃、相對濕度為40%～60%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為假手術組、模型組、新黑蘇嘎烏日勒組（540 mg/kg，根據臨床用藥劑量換算而得）、化學藥陽性對照組（尼莫地平片，16.2 mg/kg，根據臨床用藥劑量換算而得）、中藥陽性對照組（銀杏葉片，5.18 mg/kg，根據臨床用藥劑量換算而得），每組16只。各組大鼠采用改良Zea-Longa線栓法復制腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型[4]，用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射充分麻醉，分離結扎頸總動脈和頸外動脈，于頸外動脈剪開小口，插入栓線，將栓線向頸內動脈插入約（18.0±2.0） mm，松開動脈夾，并于分叉處結扎，缺血90 min后，將栓線抽離，確認無出血后乙醇消毒，涂青霉素粉，縫合皮膚；假手術組僅在動脈處備線處理，不造模。造模成功后各組大鼠每天灌胃給藥1次，連續給藥14 d。假手術組和模型組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 神經功能損傷評分

末次灌胃給藥1 h后，參照文獻[5]方法對各組大鼠進行神經功能損傷評分：無神經功能損傷癥狀，0分；提尾時對側肢體屈曲內收，1分；一側肢體抵抗力下降并有Ⅰ級癥狀，2分；自由活動時向癱疾側劃圈并有Ⅱ級癥狀，3分；意識喪失、不能行走，4分。

2.3 腦梗死率、腦含水率、腦指數的測定

神經功能損傷評分結束后，各組隨機選取10只大鼠，參考文獻[6-7]方法，斷頭處死大鼠，取出大腦，剝去腦膜、小腦和腦干，用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗，濾紙吸干表面水分并稱質量；于-20 ℃冰箱冷凍10 min后，取出大腦，切取2 mm厚度冠狀位腦片，切成5片，放入1%TTC的溶液中，37 ℃溫箱孵育20 min染色；經染色后的正常腦組織呈玫瑰紅色，腦梗死組織呈灰白色。孵育完后，將腦片置于10%甲醛中固定24 h，取出，稱腦片濕質量；剝離梗死組織，并稱其質量。將正常腦組織和梗死組織放入烘箱，105 ℃烘12 h至恒質量后，取出，稱腦片干質量，然后計算大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數。腦梗死率（%）=（梗死組織質量/腦片濕質量）×100%，腦含水率（%）=（腦片濕質量-腦片干質量）/腦片濕質量×100%，腦指數（%）=大腦質量/體質量×100%。

2.4 大鼠腦組織海馬區神經元病理學觀察

神經功能損傷評分結束后，各組取剩余6只大鼠用10%水合氯酸（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，開腹暴露心臟，灌注針刺入左心室，剪開右心耳，0.9%生理鹽水沖洗，再用4%多聚甲醛灌流固定，直至大鼠身體逐漸僵硬震顫[8]，再斷頭，于視交叉平面前后2～5 mm處冠狀切開大腦，取中間部分置于4 ℃、4%多聚甲醛中固定24 h，再乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，顯微鏡觀察大鼠腦組織海馬區神經元病理學變化。

2.5 大鼠腦前額葉BDNF和NGF 蛋白表達的檢測

取大鼠腦組織，用10%甲醛固定，24 h后組織常規脫水包埋，切片60 ℃烘烤過夜，常規脫蠟至水，3% H2O2溶液孵育10 min，沖洗，于檸檬酸鈉緩沖鹽溶液中高壓修復5 min，室溫條件下血清封閉15 min，棄血清；然后按免疫組化試劑盒說明書操作，其中一抗為大鼠BDNF抗體（1 ∶ 100）和NGF抗體（1 ∶ 150），二抗為兔抗鼠IgG抗體（1 ∶ 100）。顯微鏡觀察BDNF和NGF 蛋白表達，采用Image J軟件對經免疫組化染色后的大腦切片進行灰度值分析[9]，并計算積分光密度（IOD）。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能損傷評分結果

與假手術組比較，模型組大鼠神經功能損傷評分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學藥陽性對照組、中藥陽性對照組大鼠神經功能損傷評分顯著顯著降低（P<0.01）。

3.2 大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數的測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學藥陽性對照組、中藥陽性對照組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數測定結果見表2。

3.3 大鼠腦組織海馬區神經元病理學觀察結果

假手術組大鼠腦組織海馬區神經元細胞排列緊密層次清晰，細胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，神經細胞胞漿、核染色均勻；模型組大鼠腦組織海馬區神經元細胞排列松散，形態不規則，部分胞體皺縮，胞漿內尼氏小體減少，核仁消失。與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學藥陽性對照組、中藥陽性對照組大鼠腦海馬細胞排列相對整齊緊密，細胞核較為圓整，細胞質染色均勻，病理改變與模型組相比有所減輕。各組大鼠腦組織海馬區神經元病理學觀察結果見圖1。

3.4 大鼠腦前額葉BDNF和NGF蛋白表達結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，新黑蘇嘎烏日勒組、化學藥陽性對照組、中藥陽性對照組大鼠腦前額葉BDNF、NGF表達顯著增加（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達的免疫組化見圖2，各組大鼠腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達測定結果見表3。

4 討論

新黑蘇嘎烏日勒為我院用于治療缺血性腦中風的常用方劑，課題組前期也進行了其治療缺血性腦血管病的臨床研究[3]。由于本研究內容重點未涉及量效關系評價，因此，本實驗只設置了一個臨床療效最佳的生物等效劑量組作為考察對象，并于預試驗過程中發現其結果較為理想，最后確定540 mg/kg為最優劑量。尼莫地平片用于急性腦血管病恢復期的血液循環改善，療效確切[10-11]，故在本研究中作為化學藥陽性對照組。銀杏葉片是從植物中提取的有效成分，臨床常用于中風、半身不遂、腦梗死等[12]，故在本研究中作為中藥陽性對照組。

腦中風臨床主要表現為神志障礙、運動障礙、癱瘓；運動障礙是由于上運動神經元受損，失去了對下運動神經元的抑制調控作用，臨床上主要表現為肌張力增高，呈痙攣性癱瘓[13]。中樞性癱瘓是由于錐體束受損[14]而產生的運動障礙；周圍性癱瘓[15]又稱下運動神經元性癱瘓，是因脊髓前角細胞及腦干運動神經核受損害產生的運動障礙，由于下運動神經元受損，使其所支配的肌肉張力降低，反射減弱或消失。本研究模型組與假手術組比較，神經功能損傷評分顯著增加，說明大鼠腦中動脈阻塞-再灌注損傷未自然恢復；治療后新黑蘇嘎烏日勒組大鼠神經功能損傷評分顯著降低，說明新黑蘇嘎烏日勒可改善模型大鼠的神經功能損傷。

腦是對缺氧最敏感的器官，腦組織缺血將會引起局部腦組織功能損傷，其損傷程度與缺血時間長短有關，短期缺血會引起可逆性損傷，長時間的缺血會引起梗死，進而導致腦水腫及腦細胞壞死[16-20]。本實驗模型大鼠治療后，新黑蘇嘎烏日勒組大鼠腦梗死率、腦含水率、腦指數顯著降低，提示新黑蘇嘎烏日勒對腦梗死損傷具有改善作用。

BDNF廣泛分布于中樞神經系統中，對神經元的生長發育起重要作用[21-23]。BDNF能防止神經元受損傷死亡、促進受損傷神經元再生及分化，是中樞及周圍神經系統的神經元維持正常生理功能所必需的神經營養因子[24]。NGF可以調節神經元的生長發育，維持神經元的存活[25-26]。本研究發現，新黑蘇嘎烏日勒組BDNF、NGF的表達相比模型組顯著增加，模型組BDNF、NGF表達相比假手術組也有明顯增加，推測模型組是由于自我修復引起的增加，而新黑蘇嘎烏日勒組增加得更顯著，進而說明新黑蘇嘎烏日勒組具有促進修復的作用；提示新黑蘇嘎烏日勒可通過增加BDNF、NGF表達，促進中樞神經元的生長發育及受損傷神經元的再生及分化，改善大鼠腦中動脈阻塞-再灌注損傷。

綜上所述，蒙藥新黑蘇嘎烏日勒對大鼠腦中動脈阻塞-再灌注損傷模型大鼠具有良好的改善作用，其作用機制可能與增加腦前額葉BDNF、NGF蛋白表達有關，該實驗結果也可為其臨床應用提供實驗依據及參考。

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（收稿日期：2018-09-28 修回日期：2018-12-30）

（編輯：唐曉蓮）