橡膠樹茉莉酸信號途徑相關基因表達與橡膠產量的相關性

楊署光　趙悅　陳月異　李言　張世鑫　田維敏

摘 要：割膠促進橡膠樹合成天然橡膠與激活乳管細胞的茉莉酸信號途徑密切相關，但茉莉酸信號途徑關鍵環節的基因表達水平與干膠產量的相關性尚不清楚。為了找到與產量相關的分子標記，該研究采用qPCR技術，分析了割膠條件下茉莉酸信號途徑關鍵環節的9個相關基因在5個橡膠樹魏克漢種質和5個1981’IRRDB種質乳管細胞中的表達。結果表明：大多魏克漢種質的株次干膠產量顯著高于1981’IRRDB種質。在9個基因中，除了HbMYC4和HbMYC5，其余7個基因在大多橡膠樹魏克漢種質中的表達量均顯著高于1981’IRRDB種質，尤其是HbMYC3基因表達差異性好，與干膠產量相關性高，有望作為橡膠樹產量育種的一個分子標記。這對育種周期長的橡膠樹產量育種具有實際應用價值。

關鍵詞： 巴西橡膠樹， 割膠， 橡膠生物合成， 茉莉酸信號途徑， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， 基因表達

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）05-0641-09

Correlation between expression level of genes relatedto jasmonate signalling and rubber yield

YANG Shuguang1， ZHAO Yue2， CHEN Yueyi1， LI Yan1， ZHANG Shixin1， TIAN Weimin1*

（ 1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resources of RubberTree， Minstry of Agriculture and Rural Affoirs， P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops，Danzhou 571737， Hainan， China; 2.College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 10093， China ）

Abstract：Tapping-enhanced rubber biosynthesis is closely related to the activation of jasmonate signaling in laticifer cells of rubber tree. The relationship between the expression level of the genes involved in jasmonate signaling and dry rubber yield remains not elucidated. In the present study， the expression of nine genes related to jasmonate signaling was analyzed by qPCR in the laticifer cells of five Wichham germplasms and 5 1981’IRRDB germplasms upon tapping with S/2 d/3 tapping system. The rubber yield per tapping of most Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. Except for HbMYC4and HbMYC5， the expression level of the other seven genes in most of Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. It was noted that the expression of HbMYC3was highly different and closely related to the rubber yield， which may be used as a candidate marker for rubber yield-breeding of rubber tree.

Key words： Hevea brasiliensis， tapping， rubber biosynthesis， jasmonate signaling， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， gene expression

茉莉酸是植物應對逆境脅迫的關鍵信號分子（Qi et al.， 2011），其信號傳導的三個核心環節是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.， 2009）。在缺乏JA-Ile（活性形式JA）（Fonseca et al.，2009）時，JAZ蛋白與MYC2互作，抑制MYC2對JA響應基因的轉錄激活。例如，在擬南芥中，AtJAZ1和AtJAZ3蛋白通過抑制AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4轉錄因子，影響硫代葡萄糖苷（glucosinolate）的合成（Schweizer et al.，2013）。AtJAZ1和AtJAZ3蛋白與WD-Repeat/bHLH/MYB復合體相互作用，抑制花青素的合成（Qi et al.，2011）。但是，在JA-Ile存在的條件下，JAZ與COI1結合，進而通過26S蛋白酶體被降解，使MYC2轉錄激活JA響應基因（Donnell et al.，1996;Chini et al.，2007;Qi et al.，2011）。發生在橡膠樹乳管細胞中的橡膠生物合成是一種典型的植物類異戊二烯代謝。最近研究表明，割膠樹的乳管細胞茉莉酸含量顯著高于未開割樹，割膠促進天然橡膠生物合成與激活乳管細胞中的茉莉酸信號途徑密切相關（Deng et al.，2018）。但是，茉莉酸信號途徑關鍵環節的相關基因表達與橡膠產量的相關性尚不清楚。本研究通過分析茉莉酸信號途徑關鍵環節相關基因的表達與橡膠產量的相關性，旨在找到與產量相關的分子標記，對于育種周期長的橡膠樹產量育種具有重要的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為割齡10 a的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的5份魏克漢種質和5份1981’IRRDB種質。其中，5份魏克漢種質是經過人工選育的橡膠樹品種PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525和熱墾523;5份1981’IRRDB種質是未經人工選育的，種質編號為RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。均種植于中國熱帶農業科學院實驗場。DNaseⅠ購自天根公司;反轉錄試劑盒RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司;qPCR試劑SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物公司（TaKaRa Japan）;其他生化試劑均為進口或國產分析純試劑。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 每個種質選3株，在生產中正常割膠（S/2D d3：二分之一樹圍，陽刀，每三天割一刀）的第10刀，收集前10 min流出的膠乳，每個種質均取3株的等體積混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2 干膠產量測定方法 該研究中的干膠產量測定參照曾霞等（2006）的方法進行。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA的合成 膠乳總RNA提取參照曾日中等（2003）的方法。cDNA第一鏈的合成根據試劑盒的操作步驟進行：取1 μg膠乳總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為qPCR分析的模板。

1.2.4 基因表達分析

1.2.4.1 qPCR反應 qPCR反應體系為20 μL，其中SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol·L<SUP>-1</SUP>，每條引物終濃度均為0.2 μmol·L<SUP>-1</SUP>）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應在LightCyclerCapillaries（20 μl，Roche）毛細管中完成，在Roche Diagnostics公司的LightCycler Real Time PCR擴增儀中運行，操作按儀器使用說明書進行。qPCR反應程序：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個循環，40個循環后進行溶解曲線分析（60～95 ℃，0.2 ℃·S-1），運行結束后冷卻至40 ℃。每個樣品做2次技術性重復，Cq標準差控制在0.2以內。利用LightCycler Software 4.05軟件采集qPCR反應的Cq值。

1.2.4.2 qPCR引物篩選 根據GenBank登錄的基因的cDNA全長序列設計qPCR引物。以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標準曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴增效率，選擇擴增效率在85%以上的引物對開展實驗;通過溶解曲線峰的數目判斷引物的特異性，選擇具有單一的溶解曲線峰的引物對開展實驗;獲得的qPCR產物通過測序印證。本研究所用引物見表1。

1.2.4.3 基因表達分析 根據“Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq”計算基因的表達值（Q），以Hb18S作為內參基因，根據“E=Q目的基因/Q內參基因”分析目的基因的相對表達值（E）。樣本間相對基因表達倍數（Bénédicte et al.，2002;Silvia et al.，2012;Yuki et al.，2015）可直觀的反映出彼此間表達差異的大小，根據“F=EA÷EB”分析樣本A對樣本B的基因相對表達倍數（folds，F）。

1.3 數據處理

用Excel 2003作圖，用SPSS軟件的Duncan檢驗進行多重比較分析：標有不同大寫字母表示組間差異極顯著（P<0.01），標有不同小寫字母表示組間差異顯著（P<0.05），而標有相同小寫字母表示組間差異不顯著（P>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進行成對比較分析：P<0.01表示組間差異極顯著，P<0.05表示組間差異顯著。用SPSS軟件分析基因表達和干膠產量的Pearson相關性，P<0.01表示極顯著相關，P<0.05表示顯著相關。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹種質間株次干膠產量比較

橡膠樹不同種質間的株次干膠產量存在明顯差異（圖1）。熱墾523最高，RO/C/8 24/104最低。總體上，大多魏克漢種質的株次干膠產量顯著高于1981’IRRDB種質;RO/I/103/107在1981’IRRDB種質中最高，但僅達到在魏克漢種質中最低的PR107的水平，且顯著低于其他魏克漢種質;其余4份1981’IRRDB種質的株次干膠產量均極顯著低于魏克漢種質，且四者差異不顯著。

魏克漢種質與1981’IRRDB種質間株次干膠產量的倍數變化（表2）表明，魏克漢種質的株次干膠產量是1981’IRRDB種質的0.81～17.39倍，平均是6.81倍，不同種質間的表達倍數有明顯差異，變異系數為63.66%。

2.2 基因表達分析

2.2.1 qPCR引物篩選 以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標準曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴增效率在87%～100%之間（圖2：A）;溶解曲線分析表明，各個基因的引物均獲得單一的溶解曲線峰，表明獲得特異性的擴增產物，無模板對照（NTC）無擴增產物表明反應體系無污染（圖2：B）。

2.2.2 橡膠樹種質間茉莉酸信號途徑關鍵環節基因的表達分析

qPCR分析表明，HbCOI1（圖3：A）和HbMYC2（3：F）僅在1個（20%）1981’IRRDB種質中達到魏克漢種質的表達水平;HbJAZ2（圖3：C）和HbJAZ3（圖3：D）僅在1（20%）個魏克漢種質中低至1981’IRRDB種質的表達水平;HbJAZ1（圖3：B）有2個（40%）魏克漢種質低至1981’IRRDB種質的表達水平;HbMYC4（圖3：H）和HbMYC5（圖3：I）在魏克漢種質和1981’IRRDB種質中表達水平相當的占80%;值得注意的是，HbMYC1（圖3：E）和HbMYC3（圖3：G）在所有魏克漢種質中的表達量均顯著高于1981’IRRDB種質。統計分析表明，HbMYC1和HbMYC3在魏克漢種質組的表達量極顯著高于1981’IRRDB種質組，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3和HbMYC2的表達量顯著高于1981’IRRDB種質組，但HbMYC4和HbMYC5在兩組間的表達差異不顯著（圖3：J）。

魏克漢種質分別對1981’IRRDB種質的基因表達倍數的結果表明（表2），優勢表達基因是HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1和HbMYC3，表達倍數分別為5.30、8.96、5.09和27.79倍。但是，同一基因在不同種質間的表達倍數有明顯差異，變異系數分別為47.66%（HbCOI1）、63.01%（HbJAZ1）、72.60%（HbJAZ2）、76.41%（HbJAZ3）、32.83%（HbMYC1）、48.45%（HbMYC2）、45.77%（HbMYC3）、81.17%（HbMYC4）、58.16%（HbMYC5）。值得注意的是，除了Re ken 628 對 RO/I/103 107的表達倍數為8.74倍（0.04%），HbMYC3在5個魏克漢種質對1981’IRRDB種質的表達倍數均在10倍以上（96%）。

統計分析表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3這7個基因在魏克漢種質中的表達平均值均顯著高于1981’IRRDB種質，其中80%達到極顯著水平（圖4）。Pearson相關性分析（表3）表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因表達與干膠產量的相關性均達到0.05的顯著水平;其中，HbCOI1、HbJAZ1、HbMYC2、HbMYC3達到0.01的顯著水平， 值得注意的是 HbMYC2基因表達與干膠產量的相關性最高。

3 討論與結論

割膠促進橡膠樹合成天然橡膠，2次割膠之間的橡膠再生涉及到橡膠合成酶基因的誘導表達調控（Deng et al.， 2018; 趙悅， 2011）。割膠促進天然橡膠生物合成與激活乳管細胞中的茉莉酸信號途徑密切相關（Deng et al.，2018）。茉莉酸信號傳導的核心環節是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.，2009）;HbMYC1和HbMYC3的基因表達水平與橡膠樹種質的干膠產量正相關（盧世香，2010;何鑫，2013）。因此，可通過研究橡膠樹“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”在不同干膠產量種質中的表達差異來篩選產量相關的分子標記。

變異幅度大于2倍的基因為差異表達基因（Bénédicte et al.，2002），高產組種質膠乳中HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因的表達水平是低產組種質的2倍以上，表明這7個基因的表達水平與干膠產量正相關。其中HbMYC3基因的表達差異最大，與橡膠樹種質的干膠產量相關性最高，有望作為橡膠樹產量育種的一個的分子標記。下一步將擴大研究群體來印證該推測。

5個HbMYC家族成員中，HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3在膠乳中特異表達，而HbMYC4和HbMYC5主要在花中表達（趙悅，2011）。HbMYC4和HbMYC5的基因表達水平與橡膠樹種質的干膠產量不相關，推測參與橡膠合成調控的HbMYCs成員主要是HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3。個別的，RO/C/8 24/104中HbMYC5的基因表達水平均極顯著高于其他種質，是其他種質的4.34～9.67倍，平均是6.96倍，變異系數僅為29.15%;HbMYC5在橡膠樹中的功能尚不完全清楚，RO/C/8 24/104有望成為研究HbMYC5功能的優良材料。

“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”彼此間以及家族成員間的相互作用（趙悅，2011;劉偉，2011;何鑫， 2013;包杰，2014;肖華，2015;王靖等，2016;姚笛，2016）表明他們在調控橡膠生物合成過程中具有協同作用。盡管個別基因在個別低產種質中已達到高產種質的表達水平，但高產種質中與干膠產量相關的7個基因的整體平均表達水平均顯著并且80%極顯著高于低產種質，進一步證實了他們之間的協同作用。

韌皮部中次生乳管的分化能力（盧世香， 2010; Chen et al.， 2016）、兩次割膠之間橡膠的再生能力（Deng et al.， 2018）和排膠能力（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011; 李言等， 2015）是影響橡膠產量的3個主要因素。該研究在橡膠再生能力調控層面獲得了一些有價值的結果。非刺激割膠條件下PR107的排膠時間短以及乙烯利刺激能顯著延長其排膠時間（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011）和增加排膠量（李言等， 2015），說明其具有一定的乳管分化能力，并且排膠能力可能是限制PR107橡膠產量的主要原因之一;PR107中與干膠產量相關的7個基因均具有較高的表達水平說明其橡膠再生能力強，而其干膠產量（非刺激）相對偏低進一步證實該推測。RO/I/103/107的干膠產量在低產種質中最高，已達到PR107的水平;而與干膠產量相關的7個基因中有6個的表達水平均比較低，僅HbMYC2的表達水平與PR107相當;推測其橡膠再生能力弱，但具有一定的乳管分化能力和/或排膠能力，同時也說明單個基因對橡膠產量的貢獻不大，也證實了這些基因在調控橡膠再生中的協同（增效）作用。深入研究這3個因素對不同橡膠樹種質干膠產量的貢獻率，是一個有意義的課題。

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