桂花萜烯合酶（TPS）的生物信息學與原核表達分析

曾祥玲　鄒晶晶　王彩云

摘 要：揮發性萜烯類化合物是植物花和果實中重要的香氣活性物質，萜烯合酶（TPS）的種類和功能決定物種中萜烯類物質的多樣性。桂花作為重要的香花植物，萜烯類物質是其花香的重要成分，但有關桂花萜烯合酶的研究卻并不多。為揭示桂花萜烯類物質的生物合成機理，該研究利用生物信息學分析了4個TPS蛋白的理化性質、亞細胞定位及其結構，在原核表達系統中進行4個TPS蛋白的體外表達，并對可溶性的TPS4重組蛋白進行了體外酶反應功能分析。結果表明：（1）4個TPS蛋白的理化性質差異較小，但僅有TPS4蛋白定位于其他靶向，不含信號肽，延伸鏈的比例較低，在靠近氨基端的區域內不含延伸鏈。（2）4個TPS蛋白在原核系統中均可成功表達，但僅有TPS4獲得了可溶性重組蛋白。（3）將純化的TPS4重組蛋白分別與GPP、NDP和FPP進行反應，均只檢測到一種產物，分別為反式-β-羅勒烯、β-水芹烯和α-法呢烯。這為揭示植物萜烯類物質生物合成的分子機理提供了參考，對從蛋白水平研究桂花花香基因功能奠定了基礎。

關鍵詞： 桂花， 萜烯合酶， 原核表達， 花香

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）05-0624-09

Bioinformatic and prokaryotic expression analysis ofterpene synthase （TPS） from Osmanthus fragrans

ZENG Xiangling1，2， ZOU Jingjing1，2， WANG Caiyun2*

（ 1. School of Nuclear Technology and Chemistry & Biology， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， Hubei， China;2. Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants， Ministry of Education， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China ）

Abstract：Volatile terpenes are important aroma active compounds in flowers and fruits of plant. Diversities of terpenes are usually determined by type and function of terpene synthase in different species. Osmanthus fragransis an important fragrant plant， in which terpenes are the important components of floral scent. But there are few studies on terpene synthase in O. fragrans. To reveal the biosynthesis mechanism of terpenes inO. fragrans，we predicted the physicochemical properties， subcellular localization and structure of four TPS proteins by bioinformatics， and expressed them in prokaryotic expression system. Finally， the function of soluble TPS4 recombinant protein was analyzed by enzyme reaction in vitro. The results were as follows： （1） The physicochemical properties of the four TPS proteins had relatively little difference. Only TPS4 protein locating in other targets without signal peptide had low proportional extended strand and no extended strand near amidogen terminal. （2） All of the four TPS proteins were successfully expressed in prokaryotic system， but only TPS4 obtained soluble recombinant protein. （3） The purified TPS4 recombinant protein was reacted with GPP， NDP and FPP respectively， and only one product （trans-β-ocimene， β-phellandrene and α-farnesene） was detected. The results provide reference for functional analysis of floral scent related gene at protein level in O. fragransand for revealing the molecular mechanism of terpenes biosynthesis in plant.

Key words： Osmanthus fragrans， terpene synthase （TPS）， prokaryotic expression， floral scent

萜烯類化合物是植物中重要的揮發性物質，也是花和果實香味形成的重要活性物質，主要包含單萜、倍半萜和不規則萜類（ Moses et al.， 2013;Dudareva et al.， 2013）。不同物種間的萜烯類物質成分和含量差異很大，熊敏等（2012）分析蠟梅花揮發油成分主要為倍半萜;蕙蘭鮮花中主要是單萜類物質（張瑩等，2013）;梅花的揮發性成分中萜烯類物質含量很少（趙印泉等，2010）。物種內不同品種間在物質成分和含量上存在一定差異。杜永芹等（2013）比較不同品種蠟梅花精油成分發現，‘古蠟梅’中石竹烯占比較高，‘揚州黃’主要為β-蓽澄茄油萜。由于萜烯類化合物在物種間或品種間的多樣性，近年來已成為科學研究的熱點。植物萜烯類化合物有兩種合成途徑：2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（Methylerythritol-4-phosphate pathway， MEP）和甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway， MVA）（Nagegowda， 2010）。萜烯合酶（Terpene synthase， TPS）是作用于萜烯物質合成最后一步的反應酶，將MEP途徑產生的牻牛兒焦磷酸（Geranyl pyrophosphate， GPP）或MVA途徑產生的法泥基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate， FPP）進一步催化成各種萜烯類化合物（Tholl， 2006;Degenhardt et al.， 2009）。有的物種的TPS可催化GPP和FPP的順式異構體橙花基二磷酸（Neryl diphosphate， NDP）和Z，Z-FPP產生新的化合物（Bleeker et al.， 2011）。TPS的種類和功能往往決定物種中萜烯物質的多樣性，不同物種中萜烯合酶的種類和作用功能有很大的不同（Tholl et al.， 2005;Garms et al.， 2010;Martin et al.， 2010）。目前關于萜烯合酶的挖掘和功能分析僅在擬南芥、葡萄、獼猴桃等少數物種中比較全面，其他物種還有待研究。

桂花（Osmanthus fragrans）是著名香花植物，鮮花及精油在高端香水、香料和化妝品行業需求廣泛。桂花花朵中的揮發性成分主要有萜烯類、芳香族類和酯類等物質（曹慧等，2009;楊秀蓮等，2015）。萜烯類化合物是其主要成分，也是重要的香味活性物質，主要成分為單萜和不規則萜類（Xin et al.， 2013;Cai et al.， 2014）。不同桂花品種萜烯類物質的成分和含量差異大。Cai et al.（2014）的研究發現，‘厚瓣銀桂’中反式-β-羅勒烯最多，‘柳葉金桂’中β-紫羅蘭酮最多，而‘鎘橙丹桂’中芳樟醇最多。Zeng et al.（2015）進一步研究發現，TPS是造成不同品種間萜烯類香氣成分差異的關鍵基因，從中克隆了4個TPS基因成員，并在煙草中進行了初步的功能驗證。本研究在課題組前期研究的基礎上，對4個TPS蛋白的理化性質、亞細胞定位和結構進行生物信息分析，構建原核表達載體在大腸桿菌中進行體外表達，并純化可溶性重組蛋白進行體外酶功能的驗證，為揭示桂花萜烯類物質生物合成的分子機理提供參考，有助于將來提高和改善其他物種的香氣。

1 材料與方法

1.1 材料

所用植物材料為華中農業大學校園苗圃內光照均勻且無病蟲害的健康植株桂花品種‘柳葉金桂’（Osmanthus fragrans‘Liuye jingui’）。對取樣材料稱重后立即置于液氮中速凍，盡快轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因編碼區序列獲得 利用課題組前期克隆并已上傳NCBI基因數據庫的結果[GeneBank no. KT591180（TPS1）、KT591181（TPS2）、KT591182（TPS3）和KT591183（TPS4）]。

1.2.2 蛋白生物信息學分析 利用生物信息學分析網站（表1）預測編碼蛋白理化性質、亞細胞定位、轉運肽及蛋白質二級結構， 為原核表達載體構建和體外蛋白功能解析提供依據。

1.2.3 原核表達載體的構建 根據基因編碼序列設計引物，上游引物不含ATG起始密碼子和N-端信號肽序列，以StuI和XbaI為雙酶切位點，引物序列見表2。以實驗室保存的TA-克隆載體為模板，將目的片段連接到pET6xHN（Clontech公司）原核表達載體上，挑取陽性克隆送公司測序。測序完全正確的原核表達載體轉化Transetta（DE3）（全式金公司）感受態細胞。

1.2.4 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達及SDS-PAGE分析 挑取陽性的Transetta（DE3）菌株單克隆接種到 2 mL LB（100 mg·L-1Amp）培養基中，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養12 h 后，將菌液按 1∶50 的比例擴大培養，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養至OD600 nm為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol·L-1，在18 ℃ 150 r·min-1的條件下誘導表達14～16 h后收集菌液。以不含目的基因的pET6xHN-空載轉化的Transetta （DE3）大腸桿菌為陰性對照。取收集的菌塊加入1/10原菌液體積的1 × PBS緩沖液，加入溶菌酶至終濃度0.75 mg·mL-1，并加入DNase I至1U·mL-1，重懸，超聲波3次，每次10 s，期間在冰上放置30 s。先4 ℃ 10 000×g離心20 min，取上清至干凈的離心管中， 再用 1/10原菌液體積的1× PBS緩沖液重懸沉淀。在得到的上清和沉淀懸浮液中分別加入等體積的2×SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱3～5 min，10 000×g離心2 min，上樣進行SDS-PAGE （5 %濃縮膠，12 %分離膠），檢測蛋白表達結果。

1.2.5 重組蛋白的分離純化及體外酶活性分析 取重組蛋白表達穩定而且可溶性較好的剩余菌液沉淀，按1 mg菌體沉淀加入20 μL 菌體裂解液的比例加入HisTALON xTractor Buffer，重懸沉淀。向每2 mL HisTALON xTractor Buffer中加入1 μL DNAse（1U·μL-1），輕輕混勻，冰浴15 min，間歇性混合，4 ℃ 10 000×g離心20 min，小心收集干凈的上清液，用0.45 μm的濾膜進行抽濾。參考說明書利用HisTALONTM重力柱（Clontech公司）對重組蛋白進行純化。用Bradford方法檢測重組蛋白質的濃度，并將純化過程中收集的各組分進行SDS-PAGE分析。為了后續研究不受影響，通過PD-10柱（GE公司）過濾去除純化后蛋白溶液中過量的咪唑，并將原有的洗脫緩沖液替換成反應緩沖液[15 mmol·L-1MOPSO，12.5 %（v/v）甘油，1mmol·L-1抗壞血酸，1 μL·mL-1吐溫20，1 mmol·L-1氯化鎂，2 mmol·L-1DTT，pH 7.0]。向5 mL可密封的反應瓶中加入50 μg重組蛋白（以100 ℃ 加熱5 min的50 μg重組蛋白為對照）和終濃度為10 μmol·L-1的底物GPP、FPP或NDP，補加反應緩沖液至2 mL，混合均勻，密封。置于28 ℃的搖床，轉速125 r·min-1，反應40 min。然后將固相微萃取（SPME）萃取頭插入反應瓶內，靜置萃取40 min。萃取完成之后，進行GC-MS分析。

1.2.6 GC-MS分析 用30 m × 0.25 mm × 0.25 μm HP-5MS毛細管柱 （J & W Scientific公司）進行色譜分離，以高純度氦氣（99.999%）為載氣，流速為1.2 mL·min-1。色譜分析條件：起始柱溫40 ℃，維持3 min;以3 ℃·min-1的速度升至73 ℃，保持3 min;以 5 ℃·min-1升至220 ℃，維持2 min。結合HP5975B 四極質譜（Agilent Technologies公司）進行質譜分析，質譜條件如下：傳輸線溫度為250 ℃;離子源溫度為220 ℃;EI電離模式;電子能量為70 eV;掃描的質譜范圍45～450 amu。在相同的條件下，對C8-C40的正構烷烴標樣（每個化合物濃度為0.005 μL·mL-1）（Sigma-Aldrich公司） 進行GC-MS分析，計算目標物質的保留指數（RI）。

2 結果與分析

2.1 蛋白質理化性質分析

登錄ProtParam分析四個TPS蛋白氨基酸理化性質，結果見表3。TPS1蛋白由581個氨基酸組成，相對分子量67.27，理論等電點為5.49，負電荷殘基 Asp+Glu 82，正電荷殘基 Arg+Lys 69，半衰期為30 h，不穩定系數55.60（不穩定系數<40時穩定），屬于不穩定蛋白，脂肪系數92.19，平均疏水性為-0.274，為親水蛋白。TPS2蛋白由555個氨基酸組成，相對分子量63.68，理論等電點為6.08，負電荷殘基 Asp+Glu 74，正電荷殘基 Arg+Lys 65，半衰期為30 h，不穩定系數35.03，屬于穩定蛋白，脂肪系數87.35，平均疏水性為-0.350，為親水蛋白。TPS3蛋白由591個氨基酸組成，相對分子量68.27，理論等電點為6.07，負電荷殘基 Asp+Glu 74，正電荷殘基 Arg+Lys 67，半衰期為30 h，不穩定系數48.01，屬于不穩定蛋白，脂肪系數88.97，平均疏水性為-0.299，為親水蛋白。TPS4蛋白由548個氨基酸組成，相對分子量63.53，理論等電點為5.23，負電荷殘基 Asp+Glu 75，正電荷殘基 Arg+Lys 54，半衰期為30 h，不穩定系數52.04，屬于不穩定蛋白，脂肪系數97.12，平均疏水性為-0.247，為親水蛋白。

2.2 蛋白亞細胞定位和信號肽預測

利用常用在線工具TargetP 1.1 Server 對TPS蛋白進行亞細胞定位預測，結果見表4。TPS1定位在葉綠體中的概率為0.831，線粒體為0.131，為分泌蛋白的可能性0.028，其他的可能性為0.067，因此定位于葉綠體的可信度最高。TPS2位于葉綠體的概率為0.226，線粒體為0.530，為分泌蛋白的可能性0.028，其他的可能性為0.196，因此有可能定位于線粒體。TPS3定位于葉綠體的概率為0.409，線粒體為0.222，為分泌蛋白的可能性0.071，其他的可能性為0.245，因此可能定位于葉綠體。TPS4位于葉綠體的概率為0.145，線粒體為0.147，為分泌蛋白的可能性0.100，其他的可能性為0.804。SignalP 4.1 Server 分析4個TPS蛋白未出現明顯的信號肽和信號肽剪切位點，結果未列出。ChloroP 1.1 Server分析TPS1和TPS3的轉運肽長度分別為47個和38個氨基酸。

2.3 TPS蛋白二級結構預測

運用SPOMA預測TPS二級結構，結果如表5和圖1。TPS1蛋白中 391個氨基酸形成α-螺旋，占比最多，為67.30%;32個氨基酸形成延伸鏈，占比5.51%;21個氨基酸形成β-轉角，占比 3.61%;還有137個形成無規則卷曲，占整條鏈23.58%。TPS2蛋白中 369個氨基酸形成α-螺旋，占比最多，為66.49%; 23個氨基酸形成延伸鏈， 占比4.14%;21個氨基酸形成β-轉角，占比 3.78%;還有142個形成無規則卷曲，占整條鏈25.59%。TPS3蛋白中 399個氨基酸形成α-螺旋，占比最多，為67.51%;25個氨基酸形成延伸鏈，占比4.23%;17個氨基酸形成β-轉角，占比 2.88%;還有150個形成無規則卷曲，占整條鏈25.38%。TPS4蛋白中 379個氨基酸形成α-螺旋，占比最多，為69.16%;20個氨基酸形成延伸鏈，占比3.65%;19個氨基酸形成β-轉角，占比 3.47%;還有130個形成無規則卷曲，占整條鏈23.72%。從圖1可以看出，TPS1、TPS2、TPS3蛋白在N端均存在延伸鏈，TPS1的延伸鏈密度最大，TPS3次之，TPS2較少。TPS4的N基端沒有延伸鏈。TPS1的N端延伸鏈涵蓋59個氨基酸的區域內，TPS2涉及42個氨基酸的區域，TPS3涉及46個氨基酸的區域。

2.4 TPS重組蛋白的原核表達分析

原核表達載體的構建過程中，TPS1和TPS3分別去掉了47和38個氨基酸的轉運肽，四個蛋白的N端均增加了24個氨基酸的組蛋白標簽，經ProtParam預測的重組蛋白分子量分別為65、66、67、66 kDa。構建正確的原核表達載體轉化至大腸桿菌Transetta DE3中，經過誘導，4個重組蛋白都能夠在大腸桿菌中順利地表達，表達蛋白的分子量介于50～70 kDa之間，說明與預期的蛋白大小一致（圖2：A）。對表達的重組蛋白進行溶解度分析，結果只有TPS4蛋白在上清液中有表達，其他三個重組蛋白在上清液中幾乎檢測不到（圖2：B）。將TPS4蛋白進行進一步的蛋白分離與純化，整個蛋白的分離純化過程如圖2：C所示，最終能夠得到較好完整性和較高純度的TPS4重組蛋白，可用于進一步的蛋白功能分析。

2.5 TPS4重組蛋白的功能分析

將純化的TPS4重組蛋白與底物GPP、FPP和NDP分別在反應緩沖液中進行反應，反應產物用SPME-GC-MS 方法進行產物檢測（圖3）。由圖3可知，與經過高溫加熱失活后的TPS重組蛋白（CK）相比，未加熱蛋白與GPP反應后，在保留時間（RT）16.95 min的位置出現明顯特征峰，經過質譜特征和保留指數（RI=1 047）鑒定為反式-β-羅勒烯;與FPP反應后，在保留時間（RT=1 505）33.30min的位置出現特征峰，鑒定為α-法呢烯;與NDP反應后，在保留時間（RT=1 021）16.90 min的位置出現微弱特征峰，鑒定為β-水芹烯。該蛋白與3種底物分別進行反應，都只產生一種化合物。

3 討論

大腸桿菌原核表達系統具有遺傳背景清楚、培養簡單、應用廣泛等特點，可用于蛋白功能驗證、酶活性分析、抗體制備等多個領域 （Cabrita & Bottomley， 2004;Terpe， 2006）。獲得產量高且以可溶形式表達的外源重組蛋白是實際應用的關鍵。但是，蛋白可溶性與自身氨基酸組成、蛋白親水性、等電點等有一定關系，在原核系統中表達的真核蛋白往往以不可溶性的包涵體形式存在，不具備生物學活性（Wilkinson & Harrison， 1991;Shimada et al.， 2005）。本研究將4個桂花TPS蛋白在大腸桿菌原核系統中實現了表達，但只有TPS4獲得了可溶性蛋白，另外3個的重組蛋白均以包涵體形式存在。比較它們的理化性質發現，4個TPS蛋白均為親水性蛋白;TPS4蛋白與其他三個蛋白的理化性質相差不大，僅TPS4等電點和正電荷殘基略低，脂肪系數略高。亞細胞定位和信號肽預測發現，TPS1和TPS3定位于質體，在蛋白的氨基端分別具有明顯的47和38個氨基酸的轉運肽。去除預測轉運肽之后的TPS1蛋白等電點為5.22，脂肪系數95.19，正電荷殘基63，與TPS4蛋白相差不大（結果未列出）。可見，蛋白理化性質并不是引起其他三個TPS形成包涵體的主要原因。有研究發現，信號肽可導致原核表達系統中包涵體的形成 （Bohlmann et al.， 1998;Crowell et al.， 2002）。本研究只有TPS1和TPS3預測到明顯的轉運肽，比較4個TPS蛋白的二級結構，結果發現，TPS4中的α-螺旋比例高于另外三個，而延伸鏈比例低于另外三個蛋白。在TPS1、TPS2和TPS3靠近氨基端的區域內均有延伸鏈的存在，而TPS4的氨基端不存在延伸鏈;而且TPS1、TPS2和TPS3的氨基端延伸鏈覆蓋區域長于轉運肽預測長度，說明它們實際的信號肽長度可能大于預測值。由此說明，蛋白質二級結構延伸鏈的比率和存在區域很可能影響蛋白在原核系統表達的溶解度。

萜烯合酶是一個中等規模的蛋白家族，大多萜烯合酶都具有催化GPP和FPP的雙重功能，分別產生不同種類的萜烯類化合物（Tholl， 2006;Chen et al.， 2011）。我們前期發現，在煙草中表達4個TPS基因均只能檢測到一種產物，TPS4基因的產物是一種倍半萜物質α-法呢烯（Zeng et al.， 2015）。本研究將可溶性的TPS4蛋白分別與GPP、FPP和NDP反應，分別檢測到一種底物。相同體系下，將TPS4蛋白與GPP反應產生反式-β-羅勒烯，TPS4蛋白與FPP反應產生大量的α-法呢烯，與NDP反應只檢測到少量β-水芹烯，說明TPS4蛋白催化底物FPP的活性最高，雖可催化GPP的順式異構體NDP，但效率不高。我們前期也發現，TPS3基因在煙草中表達同樣產生反式-β-羅勒烯，而且TPS3和TPS4同聚為TPS-b亞家族（Zeng et al.， 2015）。由此說明，桂花中的TPS4具有催化GPP和FPP的雙重功能;與TPS3不僅起源較近，而且催化相同的反應，應屬同工酶。雖然，煙草中的基因表達和體外酶活性分析都證明從花瓣中獲得的TPS4可產生倍半萜α-法呢烯（Zeng et al.， 2015）。但研究發現，桂花的花瓣揮發物中很少含有倍半萜類物質，也未曾檢測到α-法呢烯的存在（曹慧等，2009;Xin et al.， 2013;楊秀蓮等，2015）。這可能是由兩方面的原因造成的：一是由于TPS4在桂花花瓣中的基因表達豐度太低;二是因為桂花花瓣中存在的FPP底物不足。本研究結果為揭示桂花萜烯類物質生物合成的機理提供參考，也為從蛋白水平研究桂花花香形成奠定基礎。

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