反式脂肪酸對肥胖大鼠氧化還原態(tài)的影響

余輝艷 范榮 化軼男 佟超 錢曉蒙 肖榮 麻微微

摘 要：目的：利用高脂飼料建立大鼠肥胖模型，通過對添加不同劑量反式脂肪酸（TFAs）喂養(yǎng)的大鼠腦及血液氧化損傷相關(guān)指標(biāo)比較，探討TFAs對肥胖大鼠腦和血液抗氧化系統(tǒng)的影響機制。方法：健康雄性SD大鼠40只，隨機分為4組：對照組（CON組）、喂飼基礎(chǔ)飼料、飲食誘導(dǎo)的肥胖組（DIO組），喂飼高脂飼料，1%及8%反式脂肪酸組（1% TFAs、8% TFAs組）喂飼添加1% TFAs及8% TFAs的高脂飼料。8周后，心臟取血后，處死動物，留取腦組織及血液以檢測相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：不同飼料喂養(yǎng)8周后，8% TFAs組大鼠腦丙二醛（MDA）含量明顯高于CON組、 DIO組與1% TFAs 組（P<0.01）;CON組、DIO組、1% TFAs及8% TFAs組大鼠腦還原型谷胱甘肽（GSH）含量依次顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;1% TFAs組大鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力低于DIO組、CON組（P<0.05）;與CON組相比，8% TFAs組大鼠腦核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P < 0.01）;8% TFAs組血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達(dá)水平顯著高于CON組（P<0.05）、DIO組（P<0.05）及1% TFAs組（P<0.01）。結(jié)論：高含量TFAs攝入可引起肥胖大鼠血液和腦發(fā)生氧化損傷，上調(diào)氧化損傷相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：反式脂肪酸;氧化損傷;肥胖

大量研究表明，過多的攝入反式脂肪酸（TFAs）與心血管疾病[1-2]、2型糖尿病[3]、癌癥[4-6]及嬰兒發(fā)育不良[7]等慢性疾病的發(fā)生有一定關(guān)系。研究表明，TFAs能引起神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致大腦認(rèn)知功能衰退[8]。大量研究表明，中年超重或肥胖與老年癡呆、阿爾茨海默病及血管性癡呆風(fēng)險增加獨立相關(guān)[9]。而肥胖人群TFAs的攝入顯著高于正常者，有研究顯示，單飽和脂肪和多不飽和脂肪的攝入增加與體重增加無關(guān)，但動物脂肪、飽和脂肪和TFAs的增加與體重的變化有顯著正相關(guān)[10-11]。TFAs的攝入增加，可能會加重肥胖人群機體氧化損傷，但具體機制還需要進(jìn)一步探討。因此，本實驗通過建立肥胖大鼠模型，觀察不同含量的TFAs的高脂肪飼料對大鼠腦和血液氧化損傷相關(guān)指標(biāo)和核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）及血紅素氧化酶（HO-1）信號通路分子的影響，探討TFAs攝入對肥胖大鼠腦氧化損傷的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

丙二醛、谷胱甘肽過氧化氫酶、谷胱甘肽、BCA（Bicinchoninic acid）蛋白檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所;HO-1單克隆抗體，美國Abcam公司;二抗（Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody），美國CST公司;Nrf2單克隆抗體，美國CST公司;二抗（Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody），美國CST公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，德國Thermo公司;通用型SYBR快速定量PCR試劑盒，美國KAPA公司;基因合成引物，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

1.2 實驗動物

1.2.1 動物及飼養(yǎng) 健康雄性SD大鼠40只，體重140～160g，SPF級別;動物飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心，溫度20～23℃，濕度50%～55%，自然采光。自由飲水及攝食，動物由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，并通過首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查。動物合格證編號：SCXK-（京）2016-0011，倫理審查編號：AEEI-2017-002 首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會。SPF級別基礎(chǔ)飼料和高脂肪飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司，分別為：基礎(chǔ)飼料，高脂飼料（脂肪供能比45%）;1% TFAs，添加1% TFAs的高脂飼料;8% TFAs，添加8% TFAs的高脂飼料。

1.2.2 動物分組與處理 動物隨機分為4組，對照組（CON，基礎(chǔ)飼料）、肥胖組（DIO，高脂飼料）、1%反式脂肪酸組（1% TFAs，添加1%TFAs的高脂飼料）、8%反式脂肪酸組（8% TFAs，添加8%TFAs的高脂飼料）。動物喂養(yǎng)8周后，采用1%水合氯醛麻醉動物后，心臟取血，3 500r/min離心15min，留取血清。動物處死后，留取腦組織迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存，以檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3 方法

1.3.1 腦和血液氧化損傷指標(biāo)的檢測 將大鼠腦組織勻漿，用BCA檢測試劑盒測定總蛋白含量。依照各個試劑盒說明書的步驟加樣反應(yīng)，使用多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，奧地利Tecan公司）測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠腦組織和血漿中還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力及GSH與GSSG比值。

1.3.2 腦組織氧化損傷相關(guān)基因水平的檢測 Real-time PCR法檢測肺組織HO-1、Nrf2 mRNA的表達(dá)。提取和純化大鼠腦組織中的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用美國Bio-Rad公司PCR儀進(jìn)行擴增，所用引物序列見表1。結(jié)果采用Bio-Rad分析軟件進(jìn)行半定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參基因，目標(biāo)基因相對表達(dá)量=2^（Ct目標(biāo)- Ct內(nèi)參）。

1.3.3 腦組織蛋白氧化損傷相關(guān)蛋白水平的檢測Western blot法檢測大鼠腦組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平。提取大鼠腦組織的總蛋白，將等量的蛋白（40 μg）在12% 的SDS-PAGE 中電泳，切取目的條帶。300 mA 低溫條件下轉(zhuǎn)膜。在5%脫脂奶粉封閉液中常溫封閉1 h。分別用大鼠HO-1、Nrf2、β-actin抗體4℃孵育過夜。將膜在TBST 中充分洗滌后，分別加入HRP 標(biāo)記的二抗（Nrf2為抗兔抗體、HO-1為抗鼠抗體），常溫孵育1 h。將膜取出，在TBST 中洗滌后，使用ECL 發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Fusion SL6，法國vilber公司產(chǎn)品）進(jìn)行顯影掃描。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果以±s表示。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)和單因素方差分析，組間比較采用LSD法或用Dunnett-T3法檢驗，P <0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFAs對肥胖大鼠一般生長發(fā)育的影響

CON組、DIO組、1% TFAs和8% TFAs組大鼠一般狀況良好。第8周大鼠體重各組間差異顯著（P < 0.01）;與CON組比較，DIO組、1% TFAs組、8% TFAs組大鼠體重均顯著升高（P<0.05）（表2）。

2.2 TFAs對肥胖大鼠抗氧化系統(tǒng)相關(guān)因子的影響

2.2.1 TFAs對肥胖大鼠腦GSH、MDA含量及 GSH-PX活力的影響 4組大鼠腦組織GSH水平呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），其中CON組與1% TFAs組（P =0.016）、CON組與8% TFAs組（P< 0.001）、DIO組與8% TFAs組（P =0.004）之間有統(tǒng)計學(xué)差異;GSSG 4組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），其中CON組與1%TFAs組（P=0.003）、CON

2.2.2 TFAs對肥胖大鼠血清GSH、MDA含量及GSH-PX活力的影響 表4顯示，CON組、DIO組、1%TFAs組及8%TFAs各組大鼠血清GSH及MDA水平無明顯差異;GSSG 4組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.045）;GSH/GSSG比值4組間無明顯差異;GSH-PX活力4組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.028），其中與CON組與1%TFAs組（P=0.034）、DIO組與1%TFAs組（P=0.004）之間有統(tǒng)計學(xué)差異，1%TFAs組GSH-PX活力低于CON組和DIO組。

2.3.1 TFAs對肥胖大鼠腦組織Nrf2及 HO-1 mRNA表達(dá)情況的影響 PCR實驗結(jié)果顯示，與CON組比較，DIO組、1% TFAs組、8% TFAs組大鼠腦組織均上調(diào)Nrf2及HO-1RNA表達(dá)水平，其中8% TFAs組顯著上調(diào)Nrf2 mRNA表達(dá)水平（P = 0.022），其余各組間增量不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

2.3.2 TFAs對肥胖大鼠腦組織Nrf2及 HO-1蛋白表達(dá)情況的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示，與CON組比較，DIO、1% TFAs、8% TFAs組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，其中8% TFAs組HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著高于CON組（P=0.002），8%TFAs組HO-1蛋白表達(dá)水平顯著高于DIO組及1%TFAs組（P=0.021;P=0.024），其余各組間差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

3 討論

本實驗以高脂肪飼料建立肥胖動物模型，結(jié)果顯示，經(jīng)過8周的飼料喂養(yǎng)，CON組及DIO組、1% TFAs、8% TFAs組大鼠一般生長發(fā)育狀況良好，DIO組大鼠體重顯著高于CON組，說明高脂肪飼料喂養(yǎng)建立的肥胖大鼠模型成功。

研究顯示，MDA能間接反映氧自由基含量和氧化損傷的程度。GSH-PX是體內(nèi)廣泛存在的催化過氧化氫分解的酶，是內(nèi)源性清除系統(tǒng)的抗氧化劑，是氧化損傷敏感的指標(biāo)之一[12]。GSH作為GSH-PX的作用底物，可清除生物體內(nèi)有害自由基或脂質(zhì)過氧化物，使其轉(zhuǎn)換成脂肪酸和水，并轉(zhuǎn)化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH/GSSG 濃度比值受外界因素干擾少，能更準(zhǔn)確地反映GSH/GSSG氧化還原對的還原能力[13]。

本研究表明，8周的不同飼料喂養(yǎng)條件下，CON組、 DIO組與1% TFAs 組在大鼠腦組織中的MDA含量無明顯差異，8% TFAs組含量明顯高于前3組，說明高含量TFAs（8% TFAs）攝入已導(dǎo)致健康及肥胖大鼠產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。CON組、DIO組、1% TFAs及8% TFAs組大鼠腦組織GSH含量依次顯著下降，說明健康及肥胖大鼠腦組織中氧化損傷加重，而清除氧自由基的能力逐漸減弱。血清中1% TFAs 組GSH-PX活力低于DIO組、CON組，表示TFAs的攝入引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)已在血液系統(tǒng)中有所體現(xiàn)。

Nrf2信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。HO-1是Nrf2調(diào)節(jié)的下游抗氧化酶基因的表達(dá)蛋白，近年來研究表明，HO-1 通過抗氧化損傷作用而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[14-15]。本研究顯示，在mRNA水平，與CON組比較，8% TFAs組顯著上調(diào)Nrf2 mRNA表達(dá)水平。在蛋白水平，8% TFAs組HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著高于CON組、DIO組及1% TFAs組，說明HO-1被激活，誘導(dǎo)抗氧化物質(zhì)的表達(dá)，起到細(xì)胞保護作用。這表明TFAs可能引起了肥胖大鼠腦氧化應(yīng)激的發(fā)生，激活了Nrf2和HO-1的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高含量TFAs可能引起肥胖大鼠腦和血液的抗氧化能力損傷，清除自由基能力下降，發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，其作用機制可能與上調(diào)Nrf2和HO-1基因和蛋白水平的表達(dá)有關(guān)，導(dǎo)致組織損傷，最后引發(fā)相關(guān)疾病的發(fā)生。

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