兩種組胺受體拮抗劑對HP-PRRS豬肺臟PRRSV核酸拷貝數的影響

劉芳 高登慧 歐德淵 萬文華

關鍵詞：PKRS;組胺;肺臟病毒核酸拷貝數測定

豬藍耳病（PRSS），又稱豬流行性流產呼吸綜合癥，主要表現在仔豬呼吸困難和母豬繁殖障礙兩個典型癥狀，PRRSV主要侵害豬的呼吸系統，肺臟發生典型的間質性肺炎。現今，用于檢測PRRSV的方法較多，其中，實時熒光定量PCR方法能測定病毒含量和區分因污染引起的假陽性，且較普通PCR方法靈敏度高，具有較好的穩定性和可重復性，操作方法簡便，同時，也減少了核酸對環境的污染，適用于樣品的大批量檢測，便于客觀分析各實驗組病毒含量的差異性，減少了由于實驗操作或環境條件變化等導致的誤差，使HP-PRRS患豬的肺臟病毒含量檢測簡便易行，且敏感度和穩定性高。

組胺是機體不可忽略的炎性因子之一，現已證實肺臟組胺受體主要是H1R和H2R，組胺能通過H1R和H2R間的相互作用，使肺微血管的通透性增加，導致肺臟微循環紊亂和病理損傷。本實驗采用熒光定量PCR法檢測各組仔豬肺部病毒核酸拷貝數，進一步探討兩種組胺受體拮抗劑對HP-PRRS患豬肺炎的影響，為防治該病奠定了一定的理論基礎。

一、材料

高致病性藍耳病病毒為貴州分離株GZKB株，由貴州省動物疫病研究室惠贈;熒光定量試劑盒，購自大連寶生物公司;Line-Gene熒光PCR儀（BYQ6009-107B），杭州博日科技有限公司;酶標儀（AC100-120），澳大利亞。

二、方法

（一）分組處理

30日齡三元雜交公仔豬20頭購自貴州省貴陽市某養豬場，仔豬均未注射藍耳病疫苗，體重為8.9～11kg，隨機分為陰性對照組、陽性對照組、撲爾敏組和西咪替丁組，每組5頭。其中，撲爾敏組、西咪替丁組、陽性組仔豬同一天肌肉注射PRRSV（10CIDso）2mL/頭，并于感染病毒前1天開始，每組每天分別肌肉注射撲爾敏1.5mL/d頭、西咪替丁1.5mL/頭、生理鹽水2mL/頭，陰性對照組仔豬為每日早晚肌肉注射生理鹽水2mL/頭。

（二）樣本處理

頸靜脈放血處死人工感染病毒第10d的各組仔豬，取新鮮肺樣立即放于液氮中，定量稱取肺樣，經定量DEPC水研磨，冷凍離心，棄沉淀留上清，用于病毒核酸拷貝數的測定。

（三）熒光定量標準曲線建立

1、標準質粒制備。用紫外分光光度計分別檢測貴州省動物疫病研究室惠贈的PRRSV N基因克隆標準質粒OD和0D，計算質粒DNA溶液的濃度，同時，按照10逐級梯度稀釋，梯度濃度，作為已知含量的標準模板，用于優化本實驗中熒光定量PCR的反應體系和條件，建立標準曲線和檢測樣品核酸拷貝數。

2、實時熒光定量PCR反應條件優化。首先進行引物合成。以制備的標準品作為模板，進行SYBR Green-I實時熒光定量PCR擴增，優化反應體系中的引物濃度、退火溫度等條件，最終確定該方法的最佳反應體系和條件。PCR反應體系為（需在冰上加樣，總量：25μL）：

3、特異性、重復性檢測及標準曲線的建立。待熒光定量PCR反應條件優化好，以PRRSV N基因標準質粒為模板，進行敏感性、重復性檢測，以CSF、PPV、JEV、SIV為對照，進行特異性檢測，特異性條件成立后建立標準曲線。

（四）肺臟病毒核酸拷貝數測定

肺樣病毒核酸反轉錄：與實驗一的反轉錄方法相同，取制備好的肺樣上清，以P1、P2為引物，反轉錄各肺樣病毒RNA為cDNA。

拷貝數測定：以cDNA為模板，設立對照組，采用與建立標準曲線相同的反應條件和體系進行實時熒光定量PCR，用標準曲線計算各樣品PRRSV拷貝數。

三、結果

（一）實時熒光定量PCR標準曲線的建立

l、PRRSV N基因實時熒光定量PCR反應條件的優化。取由貴州省動物疫病研究室惠贈的含PRRSV N基因的標準質粒進行實時熒光定量PCR條件優化，經優化的循環體系為：95℃預變性30s;95℃變性5s，5CC退火40s，72℃延伸50s，85℃解鏈引物二聚體10s，40個循環;最后72℃再延伸10rain，臺階溫度為0.5℃;95℃15s，溶解曲線。

2、PRRSV N基因實時熒光定量PCR重復性、特異性檢測。選擇標準質粒濃度為1.0x106/μL、1.0x107/μL、1.0x10s/μL、1.0x10/μL為模板，每個濃度重復設5個樣品，結果表明，相同濃度的S型擴增曲線峰值相似度高，說明N基因引物重復性好。采用相同方法檢測PRRSV N基因的特異性，除PRRSV N基因能擴增出S型曲線外，對照組均未擴增出S型曲線，說明本實驗建立的PRRSV N基因實時熒光定量PCR方法具有良好的特異性。

3、PRRSV N基因實時熒光定量PCR標準曲線的建立。將含PRRSV N基因的標準質粒倍比稀釋，采用每微升含拷貝數為1.0x10～1.0x10的模板量制定的標準曲線，線性關系較好，且相關系數為-0.997，試驗數據誤差小，結果見圖1。

（二）仔豬肺臟PRRSV拷貝數的測定

采用實時熒光定量PCR的方法測定肺臟PRRSV拷貝數，其中陽性組含量最高，撲爾敏組、西咪替丁組顯著低于陽性組（P<0.05），撲爾敏組含量最低，西咪替丁組與撲爾敏組差異不顯著，結果見表1。

四、討論

（一）關于PRRSV N基因熒光定量PCR標準曲線的建立

實時熒光定量PCR中標準曲線的制作和擴增曲線與實驗結果的可靠性密切相關。本實驗選用了與樣品結構相似的含PRRSV N基因的標準質粒，使樣品擴增效率與標準品較為接近，且本實驗中標準曲線的相關系數值為0.997，較接近1，定量較準確。實時熒光定量PCR中的擴增曲線呈s型，由于反應體系中各種物質的消耗等原因，擴增曲線最終進入平臺期，本實驗中各組仔豬肺臟PRRSV N基因的擴增曲線指數增長期的區域重復性較好，且經優化的PRRSV N基因的熒光定量PCR方法特異性、重復性、對照性等均成立，表明使用該方法所檢測的結果較準確、誤差小。

（二）組胺拮抗劑對HP-PRRS患豬病毒核酸拷貝數的影響

PRRSV在豬體內分布較廣，增殖速度較快，人工感染PRRSV仔豬的第2天，能在血液中檢測到PRRSV，在攻毒后第10天左右增殖量最大。采用熒光定量RT-PCR法研究得出，PRRSV分布于豬的多種臟器中，其中，扁桃體、淋巴結、心臟、腎臟中含量較高，肝、脾臟、肺次之，腦組織中也能檢測到病毒;人工感染PRRSV在體內的分布量與檢測時間、攻毒量、豬體抵抗力等相關，本實驗檢測人工感染PRRSV第10天仔豬肺臟病毒核酸拷貝數，陽性組肺臟PRRSV核酸拷貝數范圍與孟韓冰（2009）、方桂友（2009）等的檢測結果較相似，但實驗組中的撲爾敏組、西咪替丁組顯著較低。

組胺通過與相應的受體結合，介導不同的病理生理作用。血管組胺受體主要為H1R和H2R，肺臟組胺受體主要也是H1R和H2R，而組胺H1R具有介導炎癥反應的作用。本實驗每日注射組胺H1R和H2R拮抗劑撲爾敏和西咪替丁后，發現陽性組仔豬肺臟病毒含量較實驗組顯著最高，撲爾敏組含量最低，且撲爾敏組肺臟損傷最輕，病理學評分均較西咪替丁、陽性組低，說明組胺H1R受體拮抗劑能拮抗炎癥反應，調節機體免疫功能，減輕肺臟損傷，緩解仔豬病情，可能具有抗病毒能力。