4株禽腺病毒的鑒定和分析

胡曉苗 潘孝成 張丹俊 趙瑞宏 戴銀 潘孝成 侯宏艷 沈學懷 尹磊

摘要 [目的]對六安、郭河、宣城、肥西某養殖戶送檢的疑似腺病毒的病料進行分離鑒定，為進一步鑒別、預防和控制疾病提供科學的理論依據。[方法]首先采集病例中雞的肝臟，提取病毒DNA，根據Genbank已登錄腺病毒的hexon基因設計引物，通過PCR檢測病料中腺病毒，對擴增的序列進行連接轉化和陽性克隆子篩選，并對擴增到的序列進行測序鑒定，最后將獲得的基因序列構建進化樹分析確定安徽省部分地區禽腺病毒血清型。[結果]臨床中疑似腺病毒感染的主要癥狀為心包積液和肝臟腫大，用設計的引物均檢測出大小為599 bp的目的基因條帶，序列比對結果發現，此次檢測的腺病毒均為4型腺病毒。[結論]試驗建立了快速檢測禽腺病毒的方法，為安徽省地區禽腺病毒防控提供了理論依據。

關鍵詞 禽腺病毒;hexon;測序;血清型鑒定

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2019）06-018-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.008

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

Identification and Analysis of Four Avian Adenovirus Strains

HU Xiao-miaoet al（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective] The suspected adenovirus samples from a farmer in Lu’an， Guohe， Xuancheng and Feixi were isolated and identified， which provided a scientific theoretical basis for further identification， prevention and control of diseases. [Method] Firstly， the chicken liver was collected， the virus DNA was extracted， and the primers were designed according to the hexon gene of the adenovirus that GenBank had registered. The adenovirus was detected by PCR， the amplified sequence was transformed and the positive clone was screened， and the amplified sequence was sequenced and identified. Finally， the obtained gene sequence was constructed and analyzed by evolutionary tree to determine the fowl adenovirus serotype in Anhui Province.[Result] In clinical practice， the main symptoms of adenovirus infection were pericardial effusion and liver enlargement. The designed primers were used to detect the target gene band with a size of 599 bp. Sequence comparison results showed that all the tested adenoviruses were type 4 adenoviruses.[Conclusion] The method of rapid detection of avian adenovirus was established， which provided a theoretical basis for the prevention and control of avian adenovirus in Anhui Province.

Key words Avian adenovirus;hexon;Sequencing;Serotype identification

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，主要寄生于禽類的眼、上呼吸道、肝、腎、生殖道和消化道內，但以隱性或不顯性感染為主，一旦機體受到應激反應或其他疾病感染時，病毒就會很快發生反應而產生致病性，同時也可以作為原發性病原引起其他疾病的繼發感染。禽腺病毒有A～E 5個亞群，根據交叉中和試驗分為12個血清型，為FAV1～FAV12。查閱相關資料發現，12種血清型在致病性上都有各自的特征，而且同一血清型中的不同毒株也會有不同的致病性表現。Ⅰ群禽腺病毒的毒粒共有250個顆粒，其中結構蛋白六鄰體（hexon）含有240個殼粒，由此可見hexon占了90%以上，因而依據編碼該基因蛋白建立的PCR分子診斷方法可更準確地對該群血清型進行鑒定。病毒的傳播擴散主要經過雞胚進行垂直傳播，同時也經過水平傳播擴散，該病毒擴散能力較強，潛伏期短，發病快，正常雞接觸后極易發生感染。

2019年3—5月，筆者于安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所收集了4份疑似禽腺病毒感染家禽的肝臟作為病毒分離材料，根據Genbank已登錄腺病毒的hexon基因設計引物，尋找最佳的PCR反應體系檢測病料中腺病毒的有無，對擴增的序列進行連接轉化和陽性克隆子篩選并把擴增到的序列送至生物公司進行測序鑒定，最后將獲得的基因序列構建進化樹確定安徽省部分地區禽腺病毒血清型。經檢測4份病料均為陽性病料，與血清4型同源性最高，這為準確和快速對禽腺病毒進行檢測奠定了基礎。該試驗通過對疑似FAV病料的鑒定及測序分析，進一步了解到Ⅰ群禽腺病毒的感染流行病學特點，為其防治提供了科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

4份病料分別來源于六安某養殖戶送檢的18日齡土雞、郭河某養殖戶送檢的40日齡土雞、宣城某養殖戶送檢的20日齡白羽肉雞和肥西某養殖戶送檢的2月齡土雞。

1.2 臨床病理檢查

雞群感染后通常表現為食欲減退、萎靡不振、羽毛蓬亂，發病前無明顯的特殊行為表現，通常發病快、死亡快。禽腺病毒C種血清4型感染的病例臨床剖檢可見心包有淡黃色積液，肝臟腫大、顏色變淡有炎癥、表面有出血點等病理變化。

1.3 病毒hexon基因的PCR擴增和鑒定

1.3.1 病毒基因組DNA的提取 病毒DNA的提取參照提取試劑盒說明書操作。

1.3.2 病毒引物的設計與合成 根據Genbank公司已登錄的禽腺病毒序列設計此次試驗引物基因hexon的序列（5’3’）：上游引物為CCAAGATGGCGCACGCAACTACAA，下游引物為AGCGCGAAAGGCGTACGGAAG，預期PCR反應體系擴增的片段長度為599 bp。用設計的引物尋找PCR擴增最佳反應體系和程序，然后對4份分離的毒株進行PCR檢測。

1.3.3 基因的PCR擴增 以提取的DNA作為模板，進行目的基因的擴增。PCR反應體系為25 μl：Taq mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，滅菌蒸餾水補至25 μl，在無菌超凈臺中將上述液體加到0.5 ml EP管中，EP管事先經過高壓鍋消毒滅菌。PCR反應程序為：95℃預變性5 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環;最后72℃延伸10 min。

1.3.4 擴增基因與T載體的連接轉化PCR擴增獲得的目的條帶片段進行回收，參照瓊脂糖DNA回收試劑盒進行回收，然后進行T載體連接與轉化。①將回收的DNA片段與pMD18T Vector連接，連接體系如下：T載體（pMD18T Vector）0.5 μl，目的基因（hexon）4.5 μl，Solution Ⅰ 5.0 μl。將連接好的體系置于16℃水浴30 min。②轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞，用搖后的菌液進行PCR反應，反應體系如上所示。最后將能成功PCR檢測出擴增目的基因的菌液送去測序。測序工作由南京擎科生物技術有限公司進行。

1.3.5 陽性克隆子的篩選和序列測定 PCR擴增到目的條帶的凝膠進行回收，然后進行T載體連接與轉化后，挑選出抗性板上長出的菌落制成菌液，然后對PCR鑒定的陽性菌液進行測序，對檢測得到的序列測定結果進行拼接，經過DNAstar軟件繪制出序列峰圖，觀察其各個主峰以及突變的位點，判斷其突變率是否在正常范圍內波動。對擴增得到的hexon基因部分序列，經DNAstar軟件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列經NCBI在線BLAST進行同源性比對分析。

1.4 擴增序列的血清型鑒定

運用DNAstar軟件系統將序列與各群hexon序列進行同源性分析，根據相關參考文獻，比較hexon序列峰圖和同源性比對圖。然后根據生物公司檢測的序列結果經MegAlign軟件繪制出遺傳系統的進化樹，分析判斷4份毒株的血清型。

2 結果與分析

2.1 臨床病理的主要病理學變化

對4位養殖戶的陳述進行記錄，病畜均有采食量減少、萎靡不振、蹲伏等表現，以及不同程度的死亡現象。對病死雞進行整體觀察，發現有羽毛蓬亂、面部蒼白、營養不良等表現。經剖檢觀察，可見心包有淡黃色的積液，肝臟腫大、有出血點（圖1）。

2.2 目的基因的擴增

對提取出的4份病料的DNA用設計的hexon引物進行PCR擴增，然后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，對成功PCR電泳跑出目的條帶的凝膠進行回收，在T載體連接并轉化DH5α轉感受態細胞步驟后，挑選出抗性板上長出的單個菌落制成菌液，然后對得到的菌液進行PCR鑒定。由圖2可見，擴增得到599 bp左右的片段，與預期大小相符。

2.3 陽性克隆子的篩選

對成功PCR電泳的目的條帶的凝膠進行回收，將成功完成陽性克隆的基因送至生物公司測序，對檢測得到的序列圖經過DNAstar軟件繪制出序列峰圖（圖3），可以觀察到各個主峰以及其突變的位點，查閱相關文獻后經比對其突變率均在正常范圍內波動。

對擴增得到的hexon基因部分序列，經DNAstar軟件上下游查找后除去多余序列，之后得到的基因序列經NCBI在線BLAST分析并經同源性比對，結果顯示，4個病毒分離株的基因序列均與GenBank數據庫中的FAV最為相近。分離株的hexon基因序列與血清4型FAV分離株NIVD2、SDSX1、SDTW/SD/TA/2015、HLJDAd15、SDTW116的同源性為99%（圖4）。

2.4 病毒hexon基因的進化樹分析

根據生物公司檢測的序列結果經MegAlign軟件繪制出遺傳系統的進化樹。由圖5可見，該試驗分離的4份病料的毒株與Ⅰ群腺病毒屬于同一分支，與血清4型的禽腺病毒親緣關系更近，核苷酸序列同源性為100%。

3 討論

3.1 hexon可以作為鑒定腺病毒的重要基因

臨床診斷是診斷動物疫病最基本的方法，除了臨床診斷方法，也可用分子檢測對疾病進一步確診。腺病毒的毒粒共有252個殼粒，其中240個六鄰體，12個五鄰體，五鄰體分布在每個角上，由此可見六鄰體蛋白（hexon）占據了病毒結構的大部分。Hexon基因具有Ⅰ群禽腺病毒特異性抗原的決定簇，含有與細胞受體結合的位點，可看作病毒的一種保護基因，用hexon基因作擴增的引物可區分出A～E和不同的血清型，因此該試驗選取hexon基因進行克隆與序列分析，經鑒定4份病料的分離株均與Ⅰ群禽腺病毒C種血清4型的同源性最高，親緣關系最近。

3.2 Ⅰ群禽腺病毒的現狀及防控

通過此次試驗對FAVⅠ病料的分離鑒定分析和閱讀相關文獻后，了解到該病在雞群中的發病率近年來呈增長趨勢，且病毒擴散能力較強，感染宿主的范圍也在逐漸擴大，土雞、白羽肉雞、蛋雞、鵝、番鴨、麻鴨均出現對該病的感染病例。在大多數成年雞的體內發現了腺病毒抗體的存在，由此可見禽腺病毒以隱性感染為主。因此在飼養過程中做好生物安全防控措施至關重要，同時做好常規疫苗免疫措施，提高飼料的營養水平，增強雞的免疫力，對于已出現感染病例的養殖場，應做好相關隔離工作，控制疫病的大面積擴散。

經過查閱相關報道和臨床觀察發現，在各地養禽產業出現的腺病毒感染病例主要表現為血清4型引起的心包積液綜合征、血清8型引起的包涵體肝炎和血清1型引起的砂囊糜爛。在12個血清型中其中1型病毒的纖突上有血凝素，剩下的血清型無此特性，在臨床病例的檢查中發現同一病例中可能存在2種以上的血清型病毒。同一個血清型中的不同毒株也會對動物體產生不同的致病性，因此了解不同血清型的結構及典型致病特點對該病的診斷防控有重要意義。

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責任編輯：鄭丹丹