電針對頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞及MCP-1/CCR2信號通路的影響

彭婧嬪 譚桂蘭 賴麗金 楊曉玲

摘要 目的：觀察電針對頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞及MCP-1/CCR2信號通路的影響。方法：將45只雄性SD大鼠，按照隨機數字表法分為3組，假手術組、模型組和電針組，每組15只。除假手術組外均建立動靜力失衡性頸椎病模型，并于造模后3個月開始電針干預雙側頸夾脊穴，30 min/次，1次/d，14 d為1個療程。研究中通過電子透射電鏡觀察頸椎間盤軟骨細胞的形態判定頸椎病造模是否成功;而后采用免疫組化檢測頸椎間盤軟骨細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的表達情況;接著采用實時聚合酶鏈式反應（Real time PCR）檢測MCP-1/CCR2信號通路，觀察電針對MCP-1/CCR2信號通路的影響。結果：1）假手術組的頸椎間盤軟骨細胞表面較光滑，可見微絨毛樣凸起，細胞整體形態上類似橢圓形，細胞核形態類似一個腎臟，且細胞核完整無破損，染色質均勻;而細胞外的基質中含有豐富且排列有序的膠原纖維;模型組中的頸椎間盤軟骨細胞出現退行性改變，其細胞表面的微絨毛樣凸起明顯減少，細胞核破損，染色質明顯固縮，細胞外基質中的膠原纖維明顯減少，排列無序。提示頸椎病造模成功。2）與假手術組比較，模型組和電針組大鼠TNF-α和IL-6表達均較密集，陽性表達增多（P<0.05），其中是電針組TNF-α和IL-6表達明顯較模型組降低（P<0.05），提示電針能夠抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞的TNF-α和IL-6表達。3）與假手術組比較，模型組和電針組頸椎間盤中MCP-1/GAPDH和CCR2/GAPDH均增高，差異有統計學意義（P<0.05）;電針組與模型組比較，頸椎間盤中MCP-1/GAPDH和CCR2/GAPDH低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：電針可以抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞中TNF-α和IL-6表達，可能與抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活有關。

關鍵詞 電針;頸椎病;大鼠;椎間盤;軟骨細胞;MCP-1;CCR2;信號通路

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture on chondrocyte and MCP-1/CCR2 signaling pathway of intervertebral disc in rats with cervical spondylosis.Methods：A total of 45 male SD rats were divided into three groups according to random number table，a sham operation group，a model group and an electro-acupuncture group，with 15 rats in each group.Except for the sham operation group，the models of dynamic and static imbalance cervical spondylosis were established，and electro-acupuncture intervention on bilateral cervical Jiaji（EX-B2）acupoints was started 3 months after modeling，30 minutes a day for 14 days.In this study，the morphology of cervical intervertebral disc chondrocyte was observed by transmission electron microscopy to determine the success of cervical spondylosis modeling.Then the expression of tumor necrosis factor-alpha（TNF-alpha）and interleukin-6（IL-6）in cervical intervertebral disc chondrocyte was detected by immunohistochemistry.Then real-time polymerase chain reaction（Real-time PCR）was used to detect MCP-1/CCR2 signaling pathway and observe the effect of electroacupuncture on MCP-1/CCR2 signaling pathway.Results：1）The surface of cervical intervertebral disc chondrocyte in sham operation group was smooth，with microvilli-like protuberance，oval shape of cell as a whole，and the shape of nucleus was similar to that of a kidney，and the nucleus was intact without damage and the chromatin was uniform; the extracellular matrix contained abundant and orderly collagen fibers; the degeneration of cervical intervertebral disc chondrocyte appeared in the model group.The microvilli-like protrusions on the cell surface were significantly reduced，the nucleus was damaged，the chromatin was obviously condensed，and the collagen fibers in the extracellular matrix were significantly reduced and arranged in disorder.It is suggested that cervical spondylosis was successfully modeled.2）Compared with sham operation group，the expression of TNF-alpha and IL-6 in model group and electro-acupuncture group were more intensive and positive（P<0.05）.Among them，the expression of TNF-alpha and IL-6 in electro-acupuncture group was significantly decreased than that in the model group（P<0.05），suggesting that electro-acupuncture could inhibit the expression of TNF-alpha and IL-6 in intervertebral disc chondrocytes of rats with cervical spondylosis.3）Compared with sham operation group，MCP-1/GAPDH and CCR2/GAPDH in cervical intervertebral disc of the model group and the electro-acupuncture group increased，with statistical significance（P<0.05）; compared with model group，MCP-1/GAPDH and CCR2/GAPDH in cervical intervertebral disc of electro-acupuncture group were lower than model group，with statistical significance（P<0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can inhibit the expression of TNF-alpha and IL-6 in the chondrocyte of intervertebral disc of rats with cervical spondylosis，which may be related to the inhibition of the activation of MCP-1/CCR2 signaling pathway.

Key Words Electroacupuncture; Cervical spondylosis; rat; Intervertebral disc; Chondrocyte; MCP-1; CCR2; Signaling pathway

中圖分類號：R245.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.014

頸椎病是臨床常見疾病，由于椎間盤/椎體退行性改變后累及頸椎及其周圍組織而導致以頸肩部肌肉酸痛、手指麻木、頭暈頭痛等為主要臨床表現的一類征候群。隨著生活方式的改變，頸椎病的患患者群結構發生了變化，呈年輕化趨勢，嚴重影響生命質量，故積極開展頸椎病的防治具有重要臨床意義。針灸是中醫傳統療法，數十年來針刺夾脊穴可有效治療脊柱疾病的報道不勝枚舉，但其作用機制目前尚不明了。大量研究[3-5]顯示頸椎病的病因與炎性反應不無關系[1-3]，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是CC類細胞趨化因子，它通過與其特異性趨化因子受體-2（CCR2）受體結合，誘導單核/巨噬細胞的招募以及活化，介導機體大部分炎性反應過程的發生發展，故我們設想電針有效改善頸椎病的作用機制可能通過介導MCP-1/CCR2信號通路有關，基于此，我們進行相關動物實驗，具體如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司SD雄性大鼠45只，SPF（Speciifc Psthogen Free）級（動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006），體質量（250±20）g，相同飼養環境下，相同批次的喂養飼料，密閉飼養。

1.1.2 儀器與試劑 SDZ-Ⅱ電針治療儀（購于廣州市邦善醫療器械有限公司）;一次性使用無菌針灸針（生產廠家：蘇州醫療用品廠有限公司，規格：0.35 mm×13 mm，華佗牌）;臺式高速離心機（Eppendorf，德國，型號：5418R）;抗體MCP-1（批號：ab179886）、CCR2（批號：ab203128）和GAPDH（批號：ab181602），相應二抗（CST公司，美國，批號：1728392）;MCP-1、CCR和GAPDH引物合成序列，Tr-izol（批號：76575）和DEPC（批號：546865）均購于生工生物工程（上海）股份有限公司;iScript cDNA Synthesis kit反轉錄試劑盒（購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，批號：1728392）;Realtime PCR定量試劑盒（SYBR Green，購買于上海索萊寶生物科技有限公司，批號：4827101）;伯樂熒光定量PCR儀（購于美國BIO-RAD公司，型號：CFX384Touch）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 本研究建立動靜力失衡性頸椎病模型，對除假手術組外大鼠稱重并記錄，根據每只大鼠的體質量3 mL/kg采用10%水合氯醛腹腔注射進行常規麻醉;麻醉后在大鼠項部備皮，以頸背正中縱向切口，長度2 cm左右，用彎顳鈍性分離各層肌肉，從右側頸夾肌、頭最長肌、頸最長肌及寰最長肌開始依次橫向切斷，接著依次切除右側頸髂肋肌、頭半棘肌、右側棘上韌帶和棘間韌帶，常規術后縫合，造模完成后隨機分模型組和電針組。假手術組僅將皮膚切開后立即縫合，無需作鈍性分離和切除肌肉韌帶等其他處理。所有動物于恒溫房內蘇醒后，正常飼養3個月。按隨機數字表法分為3組，假手術組、模型組、電針組，每組15只。

1.2.2 干預方法 假手術組：正常飼養，不做任何處置。模型組：于造模3個月后，每天抓取1次，不做針刺處置。電針組：造模3個月后開始電針，取穴：參照大鼠穴位圖譜，取雙側頸夾脊穴，將大鼠固定后常規消毒穴區皮膚，直刺進針，進針深度3～5 mm，輕捻轉提插后左右兩側分別通過針柄接電針治療儀，刺激電壓為2～5 V，疏密波（2/100 Hz），強度以大鼠四肢輕度上下抖動為度。30 min/次，1次/d，連續治療14 d后處死。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 電子透射電鏡進行模型評價 以電子透射電鏡觀察頸椎間盤的超微結構，以此來判定大鼠頸椎病造模是否成功。具體步驟如下：首先以最快速度將所取頸椎間盤放入pH 7.2的前固定液中并在4 ℃放置1 d;然后在pH 7.0的脫鈣液中浸泡樣品2周（隔天換1次脫鈣液）;接著常規1 mol/L PBS漂洗后浸泡于后固定液中4 ℃放置1.5 h;常規漂洗、脫水，在丙酮與包埋劑中浸透，包埋聚合后進行超薄切片，厚度為90 nm，所有切片均于35 ℃烘烤3 h;最后以醋酸鈾染色，透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.3.2 免疫組化法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的表達 動物于造模電針干預14 d后，通過用10%水合氯醛過量麻醉致死，然后在4 ℃下將造模是C6-T2段壓尼龍魚線處脊髓及神經根剝離出來放置于4%福爾馬林中，48 h后進行常規組織脫水和透明處理，然后在二甲苯與石蠟混合液中進行滲透和常規石蠟包埋，采用美國旋轉切片機連續切片4 μm厚度，每張切片均以防脫載玻片承載并于貼片后放置在60 ℃烤箱中烘烤5 h。常規脫蠟水化后，以枸櫞酸緩沖液在微波爐中加熱至沸騰，閉門燜5 min進行抗原修復，待冷卻至室溫后PBS泡洗后加封閉液封閉10 min，防水筆在切片周圍畫好隔離圈后，加入一抗TNF-α和IL-6 4 ℃冰箱孵育過夜，次日于37 ℃烤箱中回溫45 min，PBS泡洗3次，5 min/次，加入對應二抗，室溫反應10 min，PBS泡洗3次，5 min/次，DAB顯色后再浸泡于蘇木素中復染30 s，常規脫水封片后在顯微鏡下觀察，計數，拍片。

1.2.3.3 實時定量聚合酶鏈式反應（Real time PCR）檢測MCP-1/CCR2信號通路 根據Realtime PCR定量試劑盒（SYBR Green）說明書中的具體操作方法進行檢測，提取椎間盤軟骨細胞總RNA，用紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處的光密度值，兩者相除獲得光密度比值，估算樣品中的DNA濃度，再根據cDNA反轉錄試劑盒對大鼠椎間盤軟骨細胞樣本進行反轉錄;在RNaseFree處理過的EP（50 μL）管中依次加入12.5 μL的SYBRPremixExTaqTMⅡ（2×），PCRForwardPrimer（10 μmol/L，MCP-1，CCR2，GAPDH，見表1）和PCRReversePrimer（10 μmol/L，MCP-1，CCR2，GAPDH，見表1）各1 μL，2 μL的cDNA模板，最后以8.5 μL滅菌蒸餾水將整個反應體系的終量補充到25 μL，隨后將所有樣本的EP管放入實時定量PCR擴增儀中進行Real time PCR反應，反應條件為95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、退火30 s、72 ℃延伸20 s，其中條件擴增循環40次。利用實時定量PCR儀繪出擴增曲線，進行MCP-1/GAPDH和CCR2/GAPDH的結果分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，3組數據同時符合正態分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數據不符合正態分布，則采用多組秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 頸椎病造模成功率的超微結構評定 通過透射電鏡評定大鼠頸椎病造模是否成功，假手術組的頸椎間盤軟骨細胞表面較光滑，可見微絨毛樣凸起，細胞整體形態上類似橢圓形，細胞核形態類似一個腎臟，且細胞核完整無破損，染色質均勻;而細胞外的基質中含有豐富且排列有序的膠原纖維;模型組中的頸椎間盤軟骨細胞出現退行性改變，其細胞表面的微絨毛樣凸起明顯減少，細胞核破損，染色質明顯固縮，細胞外基質中的膠原纖維明顯減少，排列無序。提示，本研究頸椎病造模成功。見圖1。

2.2 電針對頸椎間盤軟骨細胞TNF-α的影響 免疫組化TNF-α呈棕褐色陽性表達在胞質內，其中淺棕色表示TNF-α弱陽性表達，而無色表示未見TNF-α表達為陰性表達。與假手術組比較，模型組和電針組大鼠TNF-α表達均較密集，陽性表達增多（P<0.05），其中是電針組TNF-α表達明顯較模型組降低（P<0.05），提示電針能夠抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞的TNF-α表達。見圖2。

2.3 電針對頸椎間盤軟骨細胞IL-6的影響 免疫組化IL-6呈棕褐色陽性表達在胞質內，其中淺棕色表示IL-6弱陽性表達，而無色表示未見IL-6表達為陰性表達。與假手術組比較，模型組和電針組大鼠IL-6表達均較密集，陽性表達增多（P<0.05），其中是電針組IL-6表達明顯較模型組降低（P<0.05），提示電針能夠抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞的IL-6表達。見圖3。

2.5 電針對大鼠頸椎間盤軟骨細胞MCP-1/CCR2通路的影響 與假手術組比較，模型組和電針組頸椎間盤中MCP-1/GAPDH和CCR2/GAPDH均增高，差異有統計學意義（P<0.05）;電針組與模型組比較，頸椎間盤中MCP-1/GAPDH和CCR2/GAPDH低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

頸椎病屬于中醫學“痹證”“痿證”等范疇，與肝、脾、腎、督脈等關系密切，外因不外乎風寒濕邪瘀滯經絡，瘀血阻滯，勞損、外傷等[7]。大量臨床及動物研究顯示，當頸椎病發生時椎間盤及其周圍組織被異常激活，從而導致MCP-1/CCR2信號通路被活化，進一步誘導退變區域的單核/巨噬細胞發生招募和活化效應，促使炎性反應因子的釋放、轉移、重新合成等環節，從而導致椎間盤周圍的炎性反應過度增強，誘發軟骨細胞的凋亡，抑制其增殖，導致椎間盤退行性病變發生[8-9]，故我們認為減輕椎間盤局部炎性反應是治療頸椎病的關鍵。

隨著疾病研究的不斷深入，我們發現頸椎病發生發展過程中隨著椎間盤周圍的的巨噬細胞被大量激活，大量炎性反應因子譬如TNF-α、IL-6等濃度上調后對椎間盤組織產生一定的破壞效應，同時還NF-κB抑制蛋白（IκB）激酶復合體產生明顯的激活作用，促進其磷酸化過程，由此經過蛋白酶小體作用后促進其與NF-κB發生分解，NF-κB被抑制的作用明顯減弱，由此NF-κB的p50亞基暴露后產生核移位，啟動了促炎因子TNF-α、IL-6等基因的表達，由此進一步上調了TNF-α、IL-6的濃度。本研究對15只SD大鼠進行頸椎病模型制備，通過透射電鏡我們發現大鼠頸椎間盤軟骨細胞出現退行性改變，其細胞表面的微絨毛樣凸起明顯減少，細胞核破損，染色質明顯固縮，細胞外基質中的膠原纖維明顯減少，排列無序，這提示我們造模是成功的，在隨后的研究中我們發現模型組大鼠TNF-α、IL-6明顯過表達，這提示頸椎病大鼠確實存在明顯的炎性反應，且MCP-1和CCR2均有高表達，文獻[10]顯示MCP-1和CCR2相互作用產生的結合物是激活單核/巨噬細胞的關鍵產物，促進上述細胞向椎間盤組織趨化，進一步增強了椎間盤區域的炎性反應效應，促進TNF-α、IL-6等炎性反應因子的釋放，加速了椎間盤退行性病變的進程。在研究中我們發現經過電針夾脊穴干預的大鼠TNF-α、IL-6含量，或者MCP-1和CCR2基因表達都有明顯下調。

夾脊穴屬于經外奇穴，因其操作簡便，效果顯著而廣泛應用于脊柱疾病的治療。從解剖學上認為頸部夾脊穴處由背闊肌、菱形肌、斜方肌三大肌肉共同構成肌肉分布格局[11-12]，刺激此部位可以一定程度緩解上述肌肉的痙攣，明顯改善病情。從中醫角度認為夾脊穴乃督脈、膀胱經循行之處，督脈乃陽脈之海，是一身陽氣之總;足太陽膀胱經分布廣泛，本著經脈所過主治所及之理念，足太陽膀胱經所治之病廣泛[13-18]。夾脊穴是督脈與足太陽膀胱經的交匯處，有樞紐的作用，針刺夾脊穴不僅對上述2條經脈有調節作用，還可作用于其間的連接，實現對五臟六腑的調節作用。本研究結果顯示與假手術組比較，電針組TNF-α和IL-6表達明顯較模型組降低且MCP-1、CCR2表達量亦低于模型組，這提示提示電針夾脊穴能夠抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞的TNF-α、IL-6、MCP-1、CCR2的表達。

綜上所述，電針可以抑制頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞中TNF-α和IL-6表達，可能與抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活有關。

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（2019-01-03收稿 責任編輯：王明）