慢性肝病濕熱證與腸道微生態的關聯性

趙瑜 趙宇峰 彭景華

摘要 濕熱證是常見臨床證候，伴見特定胃腸道癥狀，提示濕熱證患者潛在獨特的腸道微生態特征，闡釋濕熱證的物質基礎和病理機制對于闡釋中醫證候的內涵具有重要意義。現以常見慢性肝病為例，提出濕熱證腸道微生態的研究要立足于臨床，設立好對照，通過同病異證、異病同證的比較探求濕熱證的特性和共性;并借助無菌小鼠菌群移植等現代科技手段，探討腸道微生態與濕熱證候的因果關系。以期拋磚引玉，為證候研究探索有效方法。

關鍵詞 濕熱證;腸道微生態;客觀化;慢性肝病;關聯性;中醫證候

Abstract Damp-heat syndrome is a common clinical syndrome accompanied by specific gastrointestinal symptoms，suggesting the potential unique intestinal microecological characteristics of patients with damp-heat syndrome.Explaining the material basis and pathological mechanism of damp-heat syndrome is of great significance for interpreting the connotation of traditional Chinese medicine（TCM）syndromes.Taking common chronic liver disease as an example，authors put forward that the research on intestinal microecology of damp-heat syndrome should be based on clinical practice and set up a control group，meanwhile the characteristics and similarities of damp-heat syndrome should be explored through the comparison of different syndromes of the same disease and the same syndrome of different diseases.The authors also believe that the causal relationship between intestinal microecology and damp-heat syndrome can be explored through modern scientific and technological means such as flora transplantation in sterile mice，which can provide an effective method for syndrome research and exploration.

Key Words Damp-heat syndrome; Intestinal microecology; Objectification; Chronic liver disease; Relationship; TCM syndromes

中圖分類號：R256.4;R228 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.015

辨證論治是中醫藥理論的核心，是中醫認知、治療疾病的基本思想，證候則是辨證論治核心中的靈魂。所謂“醫道在于識證、立法、用方，此三大關鍵，……然三者之中識證尤為重要”“若識證不明，開口動手便錯矣”《臨證指南醫案》。為何同一疾病會有不同的“證”的狀態？不同的疾病又有相同的“證”的狀態？自上世紀50年代起，醫學研究人員開始了以疾病臨床理化指標為基礎的證候客觀化探索，但鑒于中醫證候的整體性特征，從傳統的床實驗室或影像學數據中難以尋找證候的分類指標[1]。近年來，采用系統生物學進行中醫證候研究的相關文獻逐年增加，以血液、尿液、糞便等生物樣品為窗口，從不同“組學”層面探測特定證候下的全身“病理”狀態，得到對應“組”“群”“譜”調控規律與中醫辨證之間的關聯性，與傳統中醫通過外部特征的望聞問切推測整體證候狀態的司外揣內的診斷思路具有相通之處。系統生物學的中醫證候生物學基礎研究成為中醫藥研究的重要突破口，為中醫證候科學內涵的闡釋和中醫證候客觀化標志物譜的研究提供了思路和方法。

濕熱證是濕邪和熱邪共同為患引起的病證，是臨床上常見的證候。濕熱致病由來已久，《素問·六元正紀大論》：“溽暑濕熱相搏……民病黃癉而為跗腫”和《素問·生氣通天論》：“濕熱不攘，大筋軟短，小筋弛長”。分別記載了濕熱引起的黃疸和萎病。外感和內傷均可導致濕熱蘊結，因此，其致病性十分的廣泛，濕熱證也成為中醫證候研究的一個重要切入點[2]。探究濕熱證的物質基礎和病理機制對于闡釋中醫證候的內涵以及多種疾病的防治均具有重要意義。

1 腸道微生態是闡釋濕熱證潛在內涵的良好切入點

21世紀是精準醫學的時代，人類基因組計劃的實施推動了現代醫學研究進入這個里程。被稱為人體第二基因組的“人體微生物組”的研究有可能徹底改變醫學研究的思維模式，為全面解析人體健康奧秘開辟一個新的研究領域。正常成年人腸道棲息著1 000～1 200種不同的細菌，細菌細胞數量大約1×1014（1～2 kg），其細胞總量幾乎是人體自身細胞的10倍，而細菌微生物所攜帶的基因數量是人體自身基因數量的150倍，相當于人體的“第二個基因組”[3]。目前已發現，“第二基因組”與人體免疫、炎性反應、營養代謝、藥物作用等多種生理病理反應息息相關[4-7]，并在此基礎上形成了“腸-肝軸”“腸-腦軸”等理論體系。目前研究已證實，腸道微生態參與炎性疾病（風濕性關節炎、炎癥性腸病、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡）、腫瘤（結腸癌，肝癌）、代謝性疾病（糖尿病、肥胖、脂肪肝、動脈粥樣硬化）以及精神類疾病（自閉癥、抑郁癥）等一系列疾病的發生和發展，說明腸道微生物和宿主之間存在復雜而又動態的交互關系，對于維持宿主整體的內穩態至關重要，那么它和濕熱證候之間是否也存在內在聯系？

中醫證侯具有整體性和動態性的特點，中醫診斷講究司外揣內，問二便是中醫問診的重要環節。人體共生微生物，尤其是共生腸道微生物群的組成作為人體一種重要的涌現特性，可以忠實地反映人體的健康狀況，腸道微生態系統的動態性以及靶效的整體性與中醫證候相通。所在研究團隊前期對臨床上常見慢性肝病濕熱證患者的主要證候因子進行分析[8-10]，發現多表現出口干苦，口臭，大便臭穢、粘滯不暢，脘腹脹滿等證候，提示濕熱證患者潛在特殊的腸道微生態。尤其是當前低成本高通量測序技術的發展，對從單個微生物細胞到復雜微生物群落進行的樣本制備技術的進步，計算機以及用于數據解析的生物信息學技術的革新，極有可能實現濕熱證候的生物學基礎的闡釋。

2 腸肝軸理論提示肝病證候與腸道微生態變化密切關聯

肝臟屬于消化系統，國外學者馬歇爾（Marshall）于1998年提出“腸-肝軸”假說[11]。認為機體在遭受打擊后，一方面腸屏障功能受損，腸道內細菌和脂多糖（LPS）大量進入門靜脈系統;另一方面，肝臟內的枯否細胞等被這些LPS激活，釋放一系列炎性反應遞質，這些炎性反應遞質可進一步造成腸道黏膜及遠隔器官損傷。這一假說，揭示了慢性肝病與腸道微生態的密切關聯性。

腸道菌群廣泛參與慢性肝病的病理進程。有動物實驗發現，正常菌群建立之前，TLR4依賴途徑對幼年鼠的HBV免疫耐受起到了關鍵作用，幼年期小鼠在接受成年鼠的菌群移植后可以迅速清除病毒[12]。李蘭娟院士團隊研究發現，肝硬化患者較健康者Bacteroidetes菌門豐度降低，Proteobacteria和Fusobacteria菌門豐度升高，20個較健康者顯著升高的菌種中，多數來源于Streptococcus和Veillonella2個菌屬。在模塊或通路層面，肝硬化相關標志物涉及硝酸鹽同化或異化氨，脫氮，γ-氨基丁酸生物合成，血紅素生物合成，磷酸轉移酶系統和某些類型的膜轉運等生物功能[13]。此外，我們研究團隊也發現在Child-pugh A級的輕型慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）患者中即存在腸道菌群紊亂，來自Streptococcus，Veillonella和Haemophilus的細菌與肝功能密切相關，并且豐度隨疾病的進展升高[14]。在非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）與腸道菌群關系的相關研究中，腸道微生物可以通過誘發腸源性內毒素血癥、影響能量吸收和儲存、促進胰島素抵抗、干擾膽汁酸代謝、影響腸道短鏈脂肪酸的組成與功能、調節胃腸道激素分泌、產生內源性乙醇等多種機制影響肝臟內穩態，促進NAFLD發生或進展[15-16]，參與了單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎甚至相關肝纖維化、肝硬化各個病理階段[17]。從腸道治療慢性肝病也成為研究熱點并逐步應用到臨床實驗中，例如我國學者對長期使用抗病毒治療的HBeAg陽性CHB患者進行健康志愿者的菌群移植后，以HBeAg轉陰率為結局指標，展示出良好的療效[18]。研究證實益生菌治療可以改善NAFLD患者的肝臟脂肪沉積，降低體質量，改善炎性反應指標水平[19]。糞便菌群移植（Fecal Microbiota Transplant，FMT）也被認為是干預NAFLD的一種新型的治療方式，目前已經有從體型瘦的糞便捐贈者向活檢證實的非肝硬化NASH患者進行FMT的臨床試驗（NCT02469272），以評估對肝臟脂肪含量和損傷的影響[20]。

結合日前的腸-肝研究進展會引入如下思考：濕熱證在上述病理機制中具有什么特性？不同的肝臟疾病的濕熱證是否存在共性？

3 濕熱證腸道微生態的研究可從同病異證、異病同證的比較出發，探求濕熱證的特性和共性

雖然不少學者從模擬外部濕熱環境、移入大腸桿菌等致病體模擬外感濕熱或者使用高脂飼料模擬內生濕熱等途徑探尋濕熱證的動物模型，并發現濕熱證模型組大鼠或小鼠隨著造模時間的延長，肝組織中炎性反應遞質也逐步升高。但是總體而言，動物模型尚不能模擬證候的整體性和復雜性。相較于目前西醫成熟的體內、體外的疾病研究模型，目前尚缺乏公認的濕熱證候模型，這也增加了中醫證候的研究難度。因此，中醫證候來源于臨床癥狀信息的歸納總結，其本質的研究不能脫離臨床。中醫學有“同病異證”也有“異病同證”，提示同一疾病有不同的狀態，不同疾病也有其共性的特征。在病證結合的思路指導下進行證候研究需要設立好對照，鑒于中醫證候的多維屬性，在對照組的選擇中，“同病異證”的研究盡量選擇證候對立的證候對照組，例如虛實對照或者寒熱對照，以便凸顯差異;相反，“異病同證”研究時要盡量減小疾病差異以便探尋共性。例如，“肝膽濕熱”和“大腸濕熱”同屬濕熱證，但其癥狀表現卻不盡相同，體現出了臟腑定位的特異性。從西醫角度來說，肝臟疾病和腸道疾病本來就存在顯著的疾病機制差異，在此基礎上再次去除疾病本底并提取證候本質的共性就增加了研究的難度。不防首先降維，從同一系統疾病著手，在探尋局部系統“異病同證”的證候共性病理本質基礎上再層層加維，逐步推演到人體整體系統上的證候共性。例如NAFLD和CHB是危害我國人民健康的兩大肝病，濕熱證是其常見臨床證候，均表現為口苦，口干渴，口臭，身目發黃，大便臭穢，舌紅赤，苔黃或微黃，厚膩苔，脈滑數等證候，但是從西醫來講，兩者具備不同的病因病機。NAFLD的致病因素中，飲食是其發生發展的重要因素，膏粱厚味蘊釀濕熱為主要病因，而CHB的致病因素主要是外感邪毒（HBV感染）。因此，在相同疾病擴大證候差異，不同疾病縮小病種差異的大原則基礎上，從共同的臨床濕熱證表征出發，選擇NAFLD和CHB這樣不同病因而同臟器的疾病，并以相同疾病不同證候（例如肝腎陰虛證為對照），開展常見慢性肝病濕熱證與腸道微生態變化關系的研究，可以揭示出其共性和個性特征。

目前，已有針對濕熱證的轉錄組學、代謝組學等方面的研究，但有關濕熱證與腸道菌群研究的文獻證據極少。申請者研究團隊前期在國家“十一五”“十二五”重大科技專項（病毒性肝炎證候生物學基礎研究平臺的建立）支持下，已發現常見慢性肝病濕熱證與非濕熱證患者的腸道菌群存在明顯的差異。基于OTU水平的網絡分析顯示CHB濕熱證相較于肝郁脾虛證和無證可辨者表現出更嚴重的腸道菌群紊亂，表現為機會致病菌的豐度明顯上升，可利用食物中纖維素的潛在益生菌的豐度明顯下降。較其他證候，濕熱證者的差異細胞因子特異性富集Toll樣受體信號通路、腸道免疫網絡生產IgA信號通路和NOD樣受體信號通路[21]。Toll樣受體和NOD樣受體是兩類重要的模式識別受體，可識別各種微生物分子如脂多糖、肽聚糖，細菌胞壁鞭毛素、胞壁酰二肽等病原體相關分子模式，而分泌型IgA對于維護腸屏障和腸穩態具有重要意義[22]。基于CHB和NAFLD患者濕熱證的“異病同證”代謝組研究發現，與菌群關聯密切的氮代謝、胺代謝和丁酸代謝通路紊亂是CHB和NAFLD濕熱證者的共性表現[23]。上述腸道微生態變化以及部分代謝組學、細胞因子的研究已初步相互印證地說明濕熱證患者具有特征性腸道微生態。提示常見慢性肝病濕熱證有潛在的特定的生物學基礎和共性病理機制，腸道微環境的改變與濕熱證的發生關系密切，有待于結合臨床干預，從因果關系角度來驗證研究結果，進一步明確和闡釋濕熱證的病理基礎內涵。

4 濕熱證腸道微生態的研究要落實到因果關系的理念

隨著高通量測序技術、菌株分離技術、無菌小鼠菌群移植等技術的快速發展，整體腸道微生態的研究已經從單一的相關關系研究遞進到因果關系的探索上。例如，早在2013年，法國學者就已經通過菌群移植，發現來自具有高血糖和高血清炎性反應遞質的肥胖小鼠的糞便菌群移植給無菌鼠后，移植小鼠也表現出高血糖、高胰島素血癥和肝臟的脂質沉積，證實了腸道菌群可調節脂肪的攝取和從頭合成，從而促進肝臟的脂質沉積[24]。趙立平教授團隊將同一患者的減肥治療前后的糞便樣本移植給無菌鼠，也發現在接受減肥治療前的捐贈者糞便移植的無菌小鼠表現出了肝臟脂肪病變，而減肥治療后的糞便移植鼠未出現肝臟的脂肪病變[25]。上述研究均借助了無菌鼠菌群移植技術推論了“腸-肝”的因果關系，說明了腸道微生態菌群紊亂是誘發脂肪肝的重要病因。

另一方面，越來越多的研究證據說明中藥均有調節腸道菌群的功效[26]，其中不乏葛根芩連湯這樣的高水平臨床干預研究[27]。中醫強調以方測證。中藥干預后發生濕熱證候的改變與否與其腸道微生態的變化進行對比分析是驗證證候物質基礎的重要手段。在缺乏有效證候模型的前提下，借助于臨床干預，通過療效判定和人群篩選，結合使用無菌小鼠菌群移植等方法，將臨床治療中具有顯著病證療效患者的治療前后糞菌移植給無菌鼠以建立悉生小鼠的病證動物模型，可在排除體內其他因素干擾的前提下，通過治療前后糞菌比對，結合臨床指征分析，可以間接達到闡釋腸道菌群微生態與濕熱證候因果關系的目的。

本研究團隊的經驗復方“QSHY”方具有清濕熱的功效，前期機制研究中已明確“QSHY”方可以有效降低高脂飲食NAFLD動物模型的肝組織脂質沉積和炎性損傷，并可調節NAFLD實驗鼠腸道菌群[28-30]。本研究團隊結合前期濕熱證與腸道菌群研究的工作基礎，以NAFLD濕熱證為研究主線，結合CHB，通過異病（CHB）和異證（肝腎陰虛）為對照，開展NAFLD濕熱證患者與腸道微生態變化的相關性研究;并以清濕熱的“QSHY”方為干預手段，對NAFLD濕熱證患者的特征性腸道菌群“病理因子”進行干預性驗證。然后結合臨床療效，圍繞臨床研究中觀察和驗證得到的與慢性肝病濕熱證密切相關的腸道菌群、代謝物，基于“腸道菌群-腸黏膜免疫-肝臟病變”的病理途徑，借助無菌小鼠菌群移植的方法，建立悉生動物模型。以臨床中具有顯著病證改變的患者腸道菌群變化為擾動因素，驗證慢性肝病濕熱證相關菌群微生態對腸屏障、腸黏膜免疫和肝臟病變的影響，解析腸道菌群與宿主NAFLD濕熱證的發生發展的關系，探討腸道微生態與QSHY方劑治療的作用機制。

5 小結與展望

證候的客觀化和規范化一直是困擾中醫藥現代化的瓶頸，證候的病理機制內涵有待闡釋。我們以濕熱證者常見的胃腸道癥狀出發，認為現代研究中腸道微生態系統的動態性以及靶效的整體性與中醫證候相通，并以慢性肝病為例，針對證候研究中缺少有效動物模型，缺乏因果關系探討等困境，提出了濕熱證與腸道微生態研究的若干思考，以期拋磚引玉，為證候研究探索有效方法。同時，我們注意到，隨著目前多組學檢測技術和大數據分析技術的快速迭代，有助于中醫證候這樣高緯度復雜系統的研究。而近年來，有關于中醫證候以及方藥機制的研究，無論方法手段還是文章的數量和質量均成逐年遞增的態勢。隨著中醫藥相關研究影響力的逐步擴大，從臨床需求出發，經過科學合理的實驗設計和求證，進一步解決實際問題的過程，有利于中醫藥研究與成果應用轉化的良性互動和發展。

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（2018-09-07收稿 責任編輯：楊覺雄）