順鉑誘導顆粒細胞損傷及二仙湯含藥血清保護顆粒細胞的作用機制

楊蕾 饒晨晨 孫麗萍

摘要 目的：探討順鉑對卵巢顆粒細胞的影響及二仙湯含藥血清改善大鼠卵巢顆粒細胞損傷的作用機制。方法：選取大鼠原代卵巢顆粒細胞體外培養及順鉑處理的方法，將順鉑處理后卵巢顆粒細胞隨機分為：cDDP組、cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組，另設正常組，加入相應藥理血清連續培養48 h。采用Western Blotting法檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞bcl-2、bax蛋白表達;RT-PCR法檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞bcl-2、bax mRNA表達。結果：與正常對照組比較，cDDP組bax mRNA及蛋白表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與cDDP組比較，CDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組Bax mRNA及蛋白表達均下調，差異有統計學意義（P<0.05）。與正常組比較，cDDP組bcl-2 mRNA水平及蛋白表達下調，差異有統計學意義（P<0.05）。與cDDP組比較，CDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組bcl-2 mRNA轉錄及蛋白表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：二仙湯能夠抑制cDDP誘導的卵巢顆粒細胞損傷，其作用機制可能與調節bcl-2/bax平衡有關。

關鍵詞 二仙湯;順鉑;含藥血清;卵巢顆粒細胞;卵巢功能低下;不孕;B細胞淋巴瘤2蛋白家族

Abstract Objective：To explore the effects of cisplatin on ovarian granulosa cells and the mechanism of Erxian decoction containing serum improving the damage of ovarian granulosa cells in rats.Methods：The cisplatin-treated cells by in vitro culture and cisplatin treatment of rat primary ovarian granulosa cells were randomly divided into a CDDP group，CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group.Normal serum group was added to the corresponding pharmacological serum for 48 h.The expression levels of Bcl-2 and Bax in ovarian granulosa cells of rats in each group were detected by Western Blotting method，and the expression levels of Bcl-2 and Bax in ovarian granulosa cells of rats in each group were detected by RT-PCR.Results：Compared with the normal control group，the expression level of Bax gene and protein in CDDP group was up-regulated，with significant difference（P<0.05 or P<0.01）.Compared with CDDP group，the expression of Bax gene and protein in CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group decreased significantly（P<0.05）.Compared with the normal group，the expression of Bcl-2 in CDDP group decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）.Compared with CDDP group，the transcription level of bcl-2 gene in CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group increased significantly（P&lt;0.05）.Conclusion：Erxian Decoction can effectively inhibit the damage of ovarian granulosa cells induced by CDDP，and its mechanism may be related to the regulation of bcl-2/bax balance.

Key Words Erxian Decoction; Cisplatin; Serum containing Chinese medicine; Ovarian granulosa cells; Ovarian dysfunction; Infertility; B-cell lymphoma 2 protein family; Experimental study

中圖分類號：R289.4 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.009

順鉑（Cis-dichlorodiamine Platinum，cDDP）作為一線化療藥物已被廣泛應用于臨床，cDDP的作用機制主要是通過誘導細胞凋亡程序，殺死腫瘤細胞;在此過程中死亡受體通路以及多種蛋白質參與其中，其中包括JNK信號通路、p53和Bcl-2家族蛋白等[1]。研究發現化療藥物在治療疾病的過程中不僅能夠殺死部分腫瘤細胞，同時也會對正常組織細胞產生細胞毒作用[2]，而cDDP引起的女性生殖系統損害已成為醫學界研究的熱點之一[3]。有報道指出，cDDP能夠引起女性卵巢儲備功能下降（Diminished Ovarian Reserve，DOR），而DOR是形成卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF）的一個重要誘因[4]。李艷梅等[5]發現，cDDP會引起女性患者出現月經紊亂、閉經、甚至POF。因此，在治療腫瘤的同時保護卵巢功能、減少卵巢損傷尤為重要。二仙湯對圍絕經期綜合征的療效為臨床所公認，其治療效果得到國內外中醫界的認同[6-12]。相關動物實驗采用石蠟切片及mallory染色的方法，觀察二仙湯對cDDP模型小鼠的保護機制，結果顯示，二仙湯能夠有效改善模型小鼠卵巢功能，抑制氧化應激[7]。

本課題組前期研究發現二仙湯含藥血清能夠提高cDDP處理后顆粒細胞中E2、P表達，能夠降低卵巢顆粒細胞凋亡率，同時二仙湯含藥血清能夠上調卵巢顆粒細胞中PI3k、p-Akt、Akt的表達，通過調節PI3k/Akt信號通路途徑，抑制卵巢顆粒細胞凋亡[8]。本實驗繼續建立cDDP處理卵巢顆粒細胞模型，通過觀察各組藥物干預后bcl-2/bax mRNA基因和蛋白表達情況，進一步探究二仙湯含藥血清保護卵巢顆粒細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 選取SPF級雌性SD大鼠（22～24 d）10只，體質量（60±10）g，購自（北京）斯貝福實驗動物科技有限公司，使用許可證：SCXK（京）2011～0004。自由飲水，12 h/d光照，適應性喂養1周后，常規灌胃，制備藥理血清。本實驗獲北京中醫藥大學東方醫院動物實驗倫理委員會批準（No.BUCM-20160105081995）。10%水合氯醛麻醉處死后，立即置于75%乙醇中浸泡3 min，于超凈臺下取雙側卵巢，用預冷的Hank液清洗3次，將雙側卵巢置于無血清培養基中，刺破卵巢收集顆粒細胞。

1.1.2 藥物 二仙湯組方，淫羊藿9 g、巴戟天6 g、當歸10 g、黃柏15 g、仙茅12 g、知母10 g。由北京中醫藥大學東直門醫院提供，根據顆粒/飲片固有比計算，每只鼠用量：7.5 kg/d。注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，國藥準字H37021358）、戊酸雌二醇片（拜耳醫藥有限公司，生產批號：B01007102）均購自北京中醫藥大學東直門醫院，戊酸雌二醇片每只大鼠用量：0.009 mg/kg。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12培養基（美國Hyclone公司，生產批號：SH-30023）;胎牛血清（美國Hyclone公司，生產批號：1300510）;孕馬血清促性腺激素（以色列Prospec公司，生產批號：hor-272）;BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20160627）、RIPA蛋白裂解液（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：20160307）、SDS-PAGE分離膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：S1051）、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，生產批號：S1052）蛋白相對分子質量Marker（美國Thermo公司，生產批號：00332484）;ECL超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司，生產批號：P1010）;二抗Anti-RabbitIgG/HRP（美國Santa Cruz公司，生產批號：si30086）和Anti-MouseIgG/HRP（美國Santa Cruz公司，生產批號：si30086）;RNA提取試劑盒：Zymo Quick-RNATMMicroPrep（Catalog Nos.R1050&R1051）;反轉錄試劑盒：M-MLV First Strand RT Kit（目錄號：RT03）;PCR酶：qPCR Master Mix（Catalog：DBI-2043）;bax、bcl-2抗體（美國Santa Cruz公司，生產批號：SC1309，SC1662）。

CO2培養箱（MCO-20AIC，日本）;倒置顯微鏡（TS100，日本）;低溫離心機（3K15，美國）;多功能熒光酶標儀（SAFIRE2，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 將卵巢顆粒細胞以5×105接種于96孔板中，待細胞生長至底壁的75% ～80%時，將細胞分為4組：正常組，cDDP組，cDDP+雌二醇組，cDDP+二仙湯組。除正常組外，其余各組每孔加200 μL（終濃度為2.5 μg/mL）cDDP進行處理，37 ℃，5% CO2細胞培養箱，培養12 h。

參照文獻[21]血清制備方法，將SD大鼠隨機分為：正常組、雌二醇組、二仙湯組，每組灌胃3 d，于第4天7點末次灌胃1 h后，采用心臟取血方式，全血靜置2 h，離心提取血清，濾膜無菌過濾，-20 ℃保存。

1.2.2 給藥方法 cDDP誘導12 h后，各組進行給藥干預，正常組及cDDP組棄培養基，每孔均加入正常血清200 μL;cDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組棄培養基，依次加入各組治療雌二醇、二仙湯含藥血清200 μL，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h。

1.2.3 檢測指標與方法 蛋白印跡法（Western Blotting）檢測各組顆粒細胞中bax、bcl-2蛋白表達：分別提取各組卵巢顆粒細胞，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。經SDS聚丙烯凝膠進行電泳，轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），一抗、二抗孵育后，使用發光底物進行顯影，對bax、bcl-2蛋白進行目的條帶定性和定量分析，處理圖像，分析目標條帶。

RT-PCR檢測各組卵巢顆粒細胞中bax、bcl-2mRNA表達：提取各組大鼠卵巢顆粒細胞，加入Trizol裂解后提取總RNA，加 dNTP、MMLV和Oligo（dT）15等進行逆轉錄合成cDNA第一鏈，加入PCR引物擴充目的基因，經瓊脂糖凝膠電泳，對bax、bcl-2的目的條帶進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，則采用Tamhance′sT2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細胞bcl-2、bax蛋白表達比較 與正常組比較，cDDP處理后各組bcl-2表達明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組bcl-2蛋白表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與正常組比較，cDDP處理后各組bax蛋白表達均上調，差異有統計學意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bax蛋白表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖1、2。

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細胞bcl-2、bax mRNA表達的比較 與正常組比較，cDDP干預后各組bcl-2mRNA表達下調，差異有統計學意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bcl-2mRNA表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）;與正常組比較，cDDP干預后，各組bax mRNA表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bax mRNA表達均下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

DOR是指女性卵巢產生卵母細胞數量和質量的能力下降，并可引起女性體內性激素的異常、生育能力障礙，臨床表現為月經稀少，絕經，不孕等[9]。導致DOR最常見醫源性因素即是化療藥物損傷。化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時，存在著嚴重的細胞毒性作用，嚴重影響女性患者的身心健康。隨著癌癥、血液病及自身免疫性疾病發病率上升，化療藥物的使用率隨之上升，因此保護卵巢功能成為醫學界關注的熱點問題之一。

cDDP作為一線化療藥物，可誘導卵母細胞和顆粒細胞發生凋亡，刺激原始靜止卵泡過度活化，增加卵泡對藥物的敏感性，導致顆粒細胞凋亡[10]。cDDP動物模型能夠增加顆粒細胞凋亡，加速卵泡募集，使卵泡閉鎖增多[11]。本課題組前期實驗研究已明確cDDP能夠建立大鼠卵巢顆粒細胞損傷的細胞模型，而二仙湯中藥血清可以增加大鼠卵巢顆粒細胞中E2、P的表達，延緩顆粒細胞損傷[8]。那么，二仙湯通過激活或抑制哪條信號途徑而發揮上調模型細胞中E2、P的作用呢？我們繼續探究，建立cDDP誘導原代卵巢顆粒細胞損傷模型，通過基因及蛋白角度，觀察顆粒細胞中PI3K、AKT的表達情況，結果顯示二仙湯改善損傷性卵巢顆粒細胞的作用機制，可能與激活PI3K/AKT信號通路有關[9]。目前bcl-2、bax基因是最受關注的細胞凋亡調控基因，bcl-2能抑制細胞凋亡，延長細胞生存周期，而bax則促進細胞凋亡，二者相互拮抗，共同影響著細胞凋亡的發生[12]。因此本實驗通過cDDP處理大鼠原代卵巢顆粒細胞，運用分子生物學手段，探究二仙湯是否通過調控PI3K/AKT信號通路下游靶蛋白bax/bcl-2對cDDP大鼠卵巢顆粒細胞發揮保護作用。

本實驗cDDP能夠誘導大鼠卵巢顆粒細胞促進凋亡基因bax表達、降低凋亡抑制基因bcl-2表達，與張春燕和何援利[13]的研究結果一致。研究表明，卵泡的生長發育及閉鎖主要的作用靶點可能位于卵泡表面，依賴體內內分泌系統及卵泡的三維結構特性，通過調控顆粒細胞或卵母細胞生長增殖，而影響卵泡的作用[14]。在細胞凋亡發生過程中，PI3K/Akt信號途徑發揮著重要的生物學作用，活化的PI3K/Akt信號途徑，通過調節下游多個靶分子，參與細胞的凋亡[15]。AKT被磷酸化后可誘導bax/bcl-2、Caspase3/8/9和FOX家族磷酸化，影響細胞調亡[16];這與課題組近期工作發現相一致（論文待發表）。本實驗通過蛋白和基因水平均發現二仙湯能夠下調cDDP誘導的大鼠卵巢顆粒細胞中bax蛋白表達，上調bcl-2表達。bax/bcl-2之間的動態平衡是細胞代謝關鍵環節。研究表明，bcl-2可以通過影響氧自由基、P53、活化Raf基因等途徑抑制細胞凋亡，而bax在接受死亡信號后，進入線粒體膜，促使大量細胞色素C進入細胞質，激活caspase，誘導細胞凋亡。bax/bcl-2之間的動態平衡使細胞保持正常的代謝狀態，一旦這種增殖和凋亡的平衡被打破，細胞代謝將出現紊亂，引起疾病的發生[17-20]。同時，bcl-2能夠減少線粒體膜的通透性，抑制bax的促凋亡的生物學作用[18-21]。

綜上所述，二仙湯能夠通過調控PI3K/Akt信號通路，調控下游靶蛋白bax/bcl-2的平衡，改善CDDP誘導的大鼠卵巢顆粒細胞損傷，糾正顆粒細胞微環境，為臨床治療卵巢儲備功能低下等疾病提供理論依據。

參考文獻

[1]梁元晶，曾婷婷，路欣.化療藥物對大鼠卵巢儲備功能的影響[J].中國醫學創新，2019，16（7）：27-30.

[2]王莉，王紅英，黃群，等.siRNA LSINCT5聯合順鉑對卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響[J].現代婦產科進展，2016，25（5）：349-353.

[3]Voorhuis M，Onland-Moret NC，Janse F，et al.The significance of fragile X mental retardation gene 1 CGG repeat sizes in the normal and intermediate range in women with primary ovarian insufficiency[J].Hum Reprod，2014，29（7）：1585-1593.

[4]羅嬌，張小雨，王鈺瑩，等.不同劑量順鉑誘導小鼠卵巢功能早衰程度的差異[J].遵義醫學院學報，2013，36（1）：1-4.

[5]李艷梅，卜彥青，侯文靜，等.十七椎與多穴對痛經患者即時止痛作用的觀察：隨機對照研究[J].中國針灸，2011，31（3）：199-202.

[6]康建穎，陸月紅.二仙湯治療圍絕經期綜合癥患者的臨床療效及對性激素的影響[J].健康研究，2017，37（3）：321-323.

[7]艾浩，張海英，張玉立，等.二仙湯對順鉑損傷后小鼠卵巢功能調節作用研究[J].天津中醫藥，2013，30（5）：298-300.

[8]楊蕾，王繼峰，牛建昭，等.二仙湯含藥血清對順鉑干預的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白bcl-2、bax表達的影響[J].世界中醫藥，2017，12（4）：865-869.

[9]蔡欣悅.SF-1介導四物合劑藥理血清干預順鉑損傷后大鼠卵巢顆粒細胞Cyp19a1活性及表達的研究[D].北京：北京中醫藥大學，2017.

[10]趙笛，趙丕文，武虹波，等.二仙湯對順鉑所致大鼠卵巢早衰模型中卵巢顆粒細胞增殖及周期的影響[J].環球中醫藥，2017，10（2）：131-136.

[11]Liu X，Zhao JX，Wang Y，et al.Effects of shikonin on the proliferation and activation of T lymphocytes[J].World J Tradit Chin Med，2018，4（3）：121-126.

[12]王艷，趙上，蘇衍萍，等.亞硒酸鈉通過線粒體途徑誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡的機制[J].解剖學報，2016，47（3）：353-358.

[13]張春燕，何援利.順鉑對人卵巢黃素化顆粒細胞的毒性及凋亡的影響[J].中國藥理學通報，2008，24（6）：796-799.

[14]楊玥，房麗紅，王雪峰.Foxo3a基因調控大鼠卵巢顆粒細胞體外發育及預防順鉑對卵巢的毒性作用[J].南方醫科大學學報，2016，36（6）：796-801+813.

[15]周斌，孫博，呂會娟，等.siRNA降低MACC1基因表達對子宮內膜癌細胞增殖凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響研究[J].癌癥進展，2018，16（12）：1494-1497.

[16]葉敏，劉志強，王李俊，等.豬苓酮A通過調節Bcl-2/Bax信號通路誘導雌激素受體陰性的乳腺癌細胞凋亡研究[J].中草藥，2018，49（22）：5334-5338.

[18]續云潔.Bcl-2抑制劑ABT737通過調節糖代謝增加卵巢癌順鉑耐藥細胞凋亡敏感性機制的研究[D].長春：吉林大學，2018.

[19]贠潔，胡曉佳，段海婧，等.白藜蘆醇通過PI3K/Akt信號通路誘導子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡機制研究[J].云南中醫學院學報，2018，41（4）：13-16.

[20]趙笛，趙丕文.基于FOXO3a轉錄因子探討二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞的保護機制[D].北京：北京中醫藥大學，2017.

[21]李楊，謝莉，劉建，等.二仙湯對過氧化氫誘導的人卵巢顆粒細胞氧化損傷的保護作用[J].中國中西醫結合雜志，2019，39（3）：317-322.

（2018-09-05收稿 責任編輯：楊覺雄）