高效液相色譜法檢測二仙湯中淫羊藿黃酮類成分的含量

高芳芳 劉耀龍 李慧

摘要 目的：通過高效液相色譜法（HPLC）對二仙湯中淫羊藿黃酮類成分進行含量檢測，并采用4個不同產地的淫羊藿進行多角度分析。方法：進樣體積為1 μL;色譜柱的的溫度控制在40 ℃;流動相A以0.1%色譜純甲酸和5 mmol/L的色譜純乙酸銨均勻混合而成;流動相B以色譜純甲醇和超純水均勻混合而成，研究中進行所有高效液相色譜線性梯度洗脫程序。檢測波長設置在270 nm時可以檢測到較多的吸收峰。前期對HPLC進行常規的可靠性方法學考察，包括專屬性、精密度、穩定性等，然后進一步對淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量進行檢測分析。結果：二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品均可見良好的分離度，且不存在任何內源性的干擾物質，每一個黃酮類成分專屬性均較好。淫羊藿苷線性回歸方程：Y=34.012X-12.99;淫羊藿次苷Ⅱ線性回歸方程：Y=39.875X-7.134;朝藿定B線性回歸方程：Y=23.997X-8.416;朝藿定C線性回歸方程：Y=29.896X-15.38。淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C精密度試驗的RSD值分別為0.33%、0.64%、0.57%、0.52%;穩定性試驗RSD值分別為1.09%、1.62%、1.78%、0.41%;重復性試驗RSD值分別為2.61%、2.75%、2.48%、1.22%;二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率分別為（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%。二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液;從淫羊藿不同產地中黃酮類成分含量的角度比較，發現四川產地的淫羊藿中測得的黃酮類成分高于其他3個產地，陜西產地淫羊藿次之，其后為湖北產地淫羊藿，而湖南產地淫羊藿黃酮類成分含量最低。結論：采用HPLC檢測二仙湯中淫羊藿黃酮類成分含量具有良好的可靠性，且二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液。

關鍵詞 高效液相色譜法;二仙湯;淫羊藿苷;淫羊藿次苷Ⅱ;朝藿定B;朝藿定C

Abstract Objective：To determine the content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze Herba Epimedii from 4 different habitats.Methods：Sample volume was 1 μL; column temperature was controlled at 40 ℃; mobile phase A was homogeneously mixed with 0.1% pure formic acid and 5 mmol/L pure ammonium acetate; mobile phase B was homogeneously mixed with pure methanol and ultra-pure water.Linear gradient elution procedures of high performance liquid chromatography were studied.When the detection wavelength was set at 270 nm，more absorption peaks can be detected.In the early stage，the routine reliability methodologies of HPLC were investigated，including specificity，precision，stability，etc.Then the contents of icariin，icariin II，Icariin B，Icariin C were further determined and analyzed.Results：1）Icariin，Icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C in Erxian Decoction showed good isolation，and there was no endogenous interfering substance.Each flavonoid had good specificity. 2）The results of linear regression analysis showed that the linear regression equation of icariin was Y=34.012X-12.99; the linear regression equation of icariin II was Y=39.875X-7.134; the linear regression equation of Chaohuoding B was Y=23.997X-8.416; and the linear regression equation of Chaohuoding C was Y=29.896X-15.38. 3）The RSD values of precision tests of icariin，icariin II，Chaixiding B，Chaixiding B，and Chaixiding C were 0.33%，0.64%，0.57%，0.52%.RSD values of stability test were 1.09%，1.62%，1.78%，0.41%.RSD values of repetitive test were 2.61%，2.75%，2.48%，1.22%. 4）The average recoveries of icariin，icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C were（96.87±2.15）%，（99.46±1.52）%，（101.64±2.43）%，（99.79±2.31）%，respectively. 5）The content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction was higher than that of sample solution of single herb of Herba Epimedii.From the point of view of the content of flavonoids in different habitats of Herba Epimedii，it was found that the content of flavonoids in Herba Epimedii from Sichuan was higher than that in the other 3 habitats，followed by Herba Epimedii from Shaanxi，Herba Epimedii from Hubei，and Herba Epimedii from Hunan.The content of flavonoids was the lowest.Conclusion：The determination of flavonoids in Erxian Decoction by HPLC has good reliability，and the content of flavonoids in Erxian Decoction is higher than that of single herb of Herba Epimedii.

Key Words High performance liquid chromatography; Erxian decoction; Icariin; Icariin II; Chaohuding B; Chaohuding C; Content analysis

中圖分類號：R289.4;R284 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.006

《中醫方劑臨床手冊》中收錄了二仙湯，而這一僅由淫羊藿、仙茅、當歸、巴戟天、黃柏、知母組成的藥方，是以滋陰溫腎與益精降火并重的良方[1]，通過這2個功效對人體進行雙重調節，不僅對婦女更年期綜合征[2]、性功能減退[3]等有療效，對骨質疏松癥[4-5]，肩周炎[6-7]和老年性失眠[8-9]也有顯著的改善作用。二仙湯名字的由來，概其以淫羊藿和仙茅共為君藥，而淫羊藿又名仙靈脾，故而命名為二仙湯。仙茅的相關藥理研究較多，淫羊藿含有多種黃酮類成分，本研究以二仙湯復方水煎劑和淫羊藿單味藥水煎劑，采用高效液相色譜法（HPLC）比較2種不同形式析出的黃酮類成分進行含量測定，比較二仙湯復方水煎劑和淫羊藿單味藥水煎劑中黃酮類成分的含量。根據《中華人民共和國藥典》淫羊藿中的黃酮類成分較多，本研究主要觀察其中最為重要的4中黃酮類成分，分別是淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C[10]。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 儀器型號為APS-6080A的高效液相色譜儀購自德國AUPOS科技有限公司（其中恒溫箱、自動進樣器和熒光檢測器的儀器型號分別為：APS-5600、Spark Alias和APS-5600A）;產品型號為CNT SEC-300的色譜柱購自河南奧普斯儀器設備有限公司（孔徑：300 ，規格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;產品型號為FA2004B的電子分析天平（讀數精度：0.1 mg）購自上海精科天平儀器廠;產品型號為KQ-250DE的臺式數控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 所有對照品均由上海純優生物科技有限公司購入，其中淫羊藿苷對照品純度≥98%（對照藥品批號：489-32-7;對照品編號：P0057）、淫羊藿次苷Ⅱ對照品純度≥95%（對照藥品批號：489-32-7;對照品編號：P0057）、朝藿定B對照品純度≥98%（對照藥品批號：110623-73-9;對照品編號：P0355）、朝藿定C對照品純度≥98%（對照藥品批號：110642-44-9;對照品編號：P0356）。HPLC級色譜純乙腈和HPLC級色譜純甲醇均購自德國默克（MERCK）公司（藥品批號分別為：75-05-8;67-56-1）;HPLC級色譜純甲酸購自美國飛世爾（FISHER）公司（藥品批號：64-18-6）;HPLC級色譜純甲酸購自美國天地（ACS）公司（藥品批號：631-61-8）;本研究中所有的純凈水均由河南中美純水有限公司提供。

1.3 分析藥品 二仙湯：淫羊藿、仙茅、當歸、巴戟天均為9 g，黃柏、知母均為6 g。所有藥材均由本院藥房提供。其中淫羊藿采用4個不同產地的藥材，分別為四川、陜西、湖南、湖北。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 進樣體積為1 μL;色譜柱的的溫度控制在40 ℃;流動相A以0.1%色譜純甲酸和5 mmol/L的色譜純乙酸銨均勻混合而成;流動相B以色譜純甲醇和超純水均勻混合而成，研究中所有高效液相色譜線性梯度洗脫程序均根據表1進行。檢測波長設置在270 nm時可以檢測到較多的吸收峰。

2.2 對照品溶液配制 采用精確度為十萬分之一的電子分析天平精密分別精密稱取淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品分別各19.87 mg、19.96 mg、11.65 mg、12.03 mg，分別放置在用標簽標記好4個對照品名的10 mL容量瓶中，并用色譜純甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需質量濃度的單一對照品溶液，最終淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品的質量濃度分別為1.987 g/L、1.996 g/L、1.165 g/L、1.203 g/L。將4種對照品溶液混合搖勻后，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液配制

2.3.1 二仙湯供試品溶液配制 根據1.3二仙湯藥物組成的配比加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在125 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機過濾膜對二仙湯濃縮液進行過濾，所得的續濾液即為二仙湯供試品溶液。

2.3.2 淫羊藿單味藥供試品溶液配制 根據1.3二仙湯藥物組成中淫羊藿藥材的用量，加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在25 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機過濾膜對二仙湯濃縮液進行過濾，所得的續濾液即為淫羊藿單味藥供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液配制 根據1.3中除淫羊藿以外的二仙湯藥物組成的配比加入8倍超純水，煮沸后回流提取濃縮液2 h，分別提取3次后，定容在100 mL的容量瓶中并密閉塞緊瓶蓋，后放于超聲波中進一步濃縮提取30 min，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機過濾膜不含淫羊藿的二仙湯濃縮液進行過濾，所得的續濾液即為陰性對照供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 采用HPLC對混合對照品溶液、陰性對照供試品溶液、淫羊藿單味藥供試品溶液和二仙湯供試品溶液進行專屬性試驗，本研究結果顯示，二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品均可見良好的分離度，最重要的是這4種成分之間并不存在任何內源性的干擾物質，顯示各個成分的專屬性均較好。見圖1。

2.5 線性關系考察 根據對照品溶液配制方法將淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品溶液分別根據從低濃度到高濃度的梯度，配制6個濃度梯度的對照品溶液，每個濃度均測試3次，記錄色譜峰面積并計算平均值和繪制回歸方程，方程中縱坐標Y是各對照品的平均峰面積，橫坐標X是各對照品對應的濃度梯度，結果顯示淫羊藿苷對照品、淫羊藿次苷Ⅱ對照品、朝藿定B對照品和朝藿定C對照品溶液線性關系考察均顯示良好。見表2。

2.6 精密度試驗 取同一批次同一時間配制的二仙湯供試品溶液，連續進樣6次，檢測淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算其各自對應的RSD值，結果顯示這4個黃酮類成分的RSD值分別為0.33%、0.64%、0.57%、0.52%，符合當RSD值小于3%時，即說明高效液相色譜儀器的精密度良好。見表3。

2.7 穩定性試驗 選擇同一份二仙湯供試品溶液，根據靜置時間的從短到長（0、2、4、8、12、24 h）依次檢測二仙湯中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算各成分的RSD值，結果顯示這4個黃酮類成分的RSD值分別為1.09%、1.62%、1.78%、0.41%，符合當RSD值小于3%時，即說明二仙湯供試品溶液在靜置24 h內都能保持良好的穩定性。見表4。

2.8 重復性試驗 取6份同一批次同一制備方法制備的二仙湯供試品溶液，使用同一臺高效液相色譜儀器重復測試該供試品溶液，檢測二仙湯中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并換算各成分的RSD值，結果顯示這4個黃酮類成分的RSD值分別為2.61%、2.75%、2.48%、1.22%，符合當RSD值小于3%時，即說明二仙湯供試品溶液能夠保持良好的重復性。見表5。

2.9 回收率試驗 在含量已知的二仙湯供試品溶液6份中，每一份均加入不同量的對照品溶液，混合均勻后，對混合液和各個對照品溶液分別重復檢測6次，檢測二仙湯供試品溶液中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率，結果顯示這4個黃酮類成分的平均回收率分別為（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%，說明采用HPLC法測定二仙湯供試品溶液中黃酮類成分的含量是可靠的。

2.10 樣品檢測結果 比較二仙湯供試品溶液和淫羊藿單味藥材供試品溶液中黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C這4種黃酮類成分的含量，結果發現二仙湯供試品溶液中淫羊藿黃酮類成分的含量高于淫羊藿單味藥材供試品溶液;從淫羊藿不同產地中黃酮類成分含量的角度比較，結果發現四川產地的淫羊藿中測得的黃酮類成分高于其他3個產地，陜西產地淫羊藿次之，其后為湖北淫羊藿產地，而湖南淫羊藿產地黃酮類成分含量最低。見表6。

3 討論

近年來，二仙湯的相關藥理實驗研究發現[11-12]，其中淫羊藿含有大量的黃酮類成分，本研究欲通過對淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C等主要黃銅類成分監測并采用HPLC明確各種成分含量，為二仙湯的復方藥物質量控制提供更豐富的研究資料。高效液相色譜法作為常用快捷可靠的液相色譜技術，為復雜體系中藥復方的藥物成分分離分析提供了良好的平臺。HPLC的穩定性十分良好[13-15]，本研究結果也證實了這一點，因此本研究采用HPLC測定二仙湯中4種淫羊藿黃酮類成分能夠把每次測量的誤差降到最低，進一步保障檢測結果的準確性，為二仙湯的復方藥物質量控制和相關新制劑研究提供高可信度的參考依據。本研究通過比較二仙湯水煎劑和淫羊藿單味藥材水煎劑中淫羊藿黃酮類成分含量，結果表明二仙湯中淫羊藿黃酮類成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量均較淫羊藿單位要從水煎劑高，這4種黃酮類成分的含量以朝藿定C最高，淫羊藿苷次之，接著是淫羊藿次苷Ⅱ，而朝藿定B含量最少。本研究結果闡釋在臨床上二仙湯水煎劑有效保證了復方中黃酮類成分的含量，能夠最大化實現臨床療效。另外，本研究有進一步選擇淫羊藿常見的4個不同產地的藥材，經過對比，結果發現四川產地的淫羊藿中測得的黃酮類成分高于其他3個產地，陜西產地淫羊藿次之，其后為湖北淫羊藿產地，而湖南淫羊藿產地黃酮類成分含量最低。這4個產地中四川淫羊藿的黃酮類成分含量最高，可能與該產地的地理位置和氣候等因素有關。

綜上所述，本研究建立的HPLC同時測定二仙湯中淫羊藿黃酮類成分中的4種主要成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量，這一檢測方法不僅操作過程簡單便捷，而且方法上具有良好的精密度、穩定性和重復性[16-17]，能夠指導臨床上二仙湯的復方藥物質量控制和新藥研發提供研究基礎。

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（2019-03-13收稿 責任編輯：楊覺雄）