SDX抑制NLRP3炎癥小體激活以減輕糖尿病視網膜微血管滲漏

李靜仁?李婷?何學敏?周麗?唐喜香?陳燕銘

【摘要】 目的 探討舒洛地特（SDX）治療糖尿病視網膜病變的可能性及分子機制。方法 將40只C57BL/6J小鼠隨機分成4組各10只，分別為對照+生理鹽水（Con + NS）組、對照+舒洛地特（Con + SDX）組、糖尿病+生理鹽水（DM+NS）組和DM + SDX組，SDX的用量為腹腔注射10 mg/（kg·d）、持續12周，對照給予等量生理鹽水。采用高糖（25 mmol/L葡萄糖）處理人視網膜微血管內皮細胞（HRMEC）以模擬糖尿病刺激，并與一系列濃度的SDX（0.125、0.25、0.5、1.0 lsu/ml）共處理。用伊文思藍法檢測小鼠視網膜的滲漏情況，用蛋白免疫印跡法、激光共聚焦等技術檢測小鼠視網膜組織和HRMEC中的核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體的表達和激活情況，以及凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、Caspase-1的變化。結果 DM + NS組伊文思藍吸光度、NLRP3炎癥小體及ASC的表達均較Con + NS組高，而DM + SDX組則低于DM + NS組（P均< 0.05）。SDX抑制糖尿病小鼠視網膜滲漏、NLRP3炎癥小體激活和視網膜微血管滲漏。HRMEC的NLRP3炎癥小體組分和cleaved Caspase-1在高糖刺激下表達上調（P均< 0.05）;經不同濃度的SDX處理后，NLRP3炎癥小體的表達被抑制，抑制程度隨SDX濃度的增加而增加（P均< 0.05）。結論 舒洛地特能抑制糖尿病誘導的NLRP3炎癥小體激活和視網膜微血管滲漏，可用于治療糖尿病視網膜病。

【關鍵詞】 舒洛地特;糖尿病視網膜病變;核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白3炎癥小體;

? ? 微血管滲漏;人視網膜微血管內皮細胞

Sulodexide alleviates retinal microvascular leakage by inhibiting the activation of NLRP3 inflamm-asome in diabetic retinopathy Li Jingren， Li Ting， He Xuemin， Zhou Li， Tang Xixiang， Chen Yanming. Department of Endocrinology & Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Chen Yanming

【Abstract】 Objective To investigate the feasibility and molecular mechanism of sulodexide in the treatment of diabetic retinopathy. ?Methods Forty C57BL/6J mice were randomly into the control + normal saline （Con + NS group）， control + sulodexide （Con + SDX group）， diabetes mellitus + normal saline （DM + NS group） and diabetes mellitus + sulodexide groups （DM + SDX group）. Sulodexide was intraperitoneal injected at a dose of 10 mg/（kg·d） for 12 weeks， and an equivalent quantity of phosphate buffer saline （PBS） was given in the control group. Human retinal microvascular endothelium cells （HRMECs） were stressed by high glucose （25 mmol/L） to mimic the diabetic conditions， and co-treated with a serial doses of sulodexide （0.125， 0.25， 0.5 and 1.0 lsu/ml）. The mouse retinal vascular leakage was evaluated by the Evans blue assay. The expression and activation of nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） inflammasome in the retinal tissues and HRMEC of mouse models， and the changes of the apoptosis-associated speckle-like protein containing CARD （ASC） and caspase-1 were measured by Western blot and laser confocal imaging， etc. ?Results The absorbance value of Evans blue assay and the expression levels of NLRP3 inflammasome and ASC in the DM + NS group were significantly higher compared with those in the Con + NS group， whereas the values in the DM + SDX group were considerably lower than those in the DM + NS group （all P < 0.05）. Sulodexide significantly inhibited the increased retinal leakage， the activation of NLRP3 inflammasome and attenuated the retinal vascular leakage in mouse models. The expression levels of NLRP3， Caspase-1 and cleaved Caspase-1 of HRMEC were significantly up-regulated under the condition of high glucose （all P < 0.05）. After treatment with different concentrations of sulodexide， the expression levels of NLRP3 and ASC were significantly down-regulated in a dose-dependent manner （both P < 0.05）. ?Conclusion Sulodexide can inhibit the DM-induced activation of NLRP3 inflammasome and retinal microvascular leakage， which can be applied to treat diabetic retinopathy.

【Key words】 Sulodexide;Diabetic retinopathy;

Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome;

Microvascular leakage;Retinal microvascular endothelial cell

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一[1]。視網膜血管內皮功能紊亂在DR的發病中起重要作用[2-3]。核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白3（NLRP3）屬于核苷酸結合寡聚域樣受體（NLR）家族，其與細胞凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和Caspase-1的前體蛋白組合形成NLRP3炎癥小體，激活下游炎癥通路[4]。近期研究顯示，NLRP3炎癥小體在糖尿病小鼠的視網膜和高糖刺激的人視網膜微血管內皮細胞（HRMEC）中均處于激活狀態[5-6]，提示NLRP3炎癥小體可能參與了高血糖導致視網膜血管內皮功能紊亂的過程。舒洛地特（SDX）屬于糖胺聚糖，由低分子肝素和硫酸皮膚素組成[7]。多項研究表明，SDX有內皮細胞保護作用。我們課題組的前期研究顯示，SDX可阻礙高血糖引起HRMEC的p-NF-κB p6及炎癥因子TNF-α、人單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）升高[8]。但SDX是否通過抑制NLRP3炎癥小體的激活和表達來改善DR的視網膜微血管內皮功能仍有待探討。

材料與方法

一、主要材料與試劑

HRMEC購自美國Sciencell公司。鏈脲佐菌素（STZ，S0130）、D-葡萄糖（G7021）、伊文思藍（EB，E2129）粉末購自美國Sigma公司;SDX由意大利阿爾法韋士曼制藥公司惠贈;NLRP3抗體（AG-20B-0014-C100）、ASC抗體（AG-25B-0006 -C100）購自瑞士Adipogen公司;pro-Caspase-1 +

p10 + p12抗體（ab179515）、Caspase-1抗體（ab 1872）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔二抗（ab97051）、Alexa Fluor? 488偶聯的兔熒光二抗（ab150077）、Alexa Fluor? 647偶聯的小鼠熒光二抗（ab150115）、含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的固封劑（ab104139） 購自英國Abcam公司;β-actin抗體（A5441）購自美國Sigma公司;HRP標記的小鼠二抗（7076P2）購自美國 Cell Signaling Technology公司。

二、動物模型的分組、建立和處理

C57BL/6小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心。C57BL/6J小鼠40只，將其隨機分成4組各10只，

分別為對照+生理鹽水（Con + NS）組，對照+

SDX ?（Con + SDX）組，糖尿病+生理鹽水（DM+ NS）組和DM + SDX組。糖尿病模型是基于60%高脂食物喂養6周后予以單次腹腔注射STZ（100 mg/kg）而建立[9]。處理1周后小鼠血糖值高于16.7 mmol/L的則為糖尿病建模成功。Con + SDX組與DM + SDX組均連續12周腹腔注射SDX 10 mg/（kg·d）;Con + NS組與DM + NS組則注射等量生理鹽水。本研究經中山大學實驗動物管理與使用委員會批準。

三、EB法檢測血管通透性

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉小鼠，從其尾靜脈注射EB 50 mg/kg后將其置于37℃熱毯上2 h，使EB循環全身。取其右側眼球置于4%多聚甲醛中，室溫固定30 min，而后將視網膜鋪片，在激光共聚焦顯微鏡上用405 mm波長拍攝視網膜微血管滲漏情況。摘取小鼠右側眼球后用37℃磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注其心臟2 min，然后摘取左側眼球，取視網膜組織置于150 μl甲酰胺中，用超聲裂解，之后將其置于70℃水浴18 h，1 200轉/分離心30 min后取上清，用620 mm波長檢測其吸光度值[10]。

四、眼球冰凍切片

麻醉小鼠及用PBS灌注心臟操作如上述，之后取其眼球置于OCT膠中包埋，置于干冰上迅速固定。于冰凍切片機中切片，并置于-80℃保存。

五、免疫熒光染色

將眼球切片放置于室溫15 min晾干，之后將其浸泡于磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）中洗去OCT膠;將接種于玻底培養皿的細胞用PBST浸洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛室溫固定切片或細胞10 min，用PBST浸洗3次，每次5 min。將0.2% TritonX-100溶于1% BSA溶液中，破膜1 h，用PBST浸洗3次，每次5 min。加入NLRP3抗體（1∶200）、ASC抗體（1∶200）、Caspase-1抗體（1：200），放置于濕盒中4℃過夜，然后用PBST浸洗3次，每次5 min。加入帶熒光的二抗，放置于濕盒中室溫孵育1 h，之后用PBST浸洗3次，每次5 min。加入含DAPI的固封劑封片。在激光共聚焦相應波長上拍攝對應蛋白的表達情況和位置分布。

六、細胞培養

以1×105細胞/孔將HRMEC種于6孔板上（6組）。在細胞完全貼壁后，加入2 ml的PBS洗滌3次，第1組給予低糖培養基（完全ECM培養基含5 mmol/L葡萄糖），第2 ～ 6組給予高糖培養基（完全ECM培養基含25 mmol/L葡萄糖），第3 ～ 6組分別加入不同濃度度的SDX （0.125、0.25、0.5、1.0 lsu/ml）。每24 h換1次培養液， 48 h后收集細胞進行蛋白免疫熒光染色檢測其中NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達情況。

七、統計學處理

采用SPSS 20.0 進行統計學分析。實驗重復3次及以上，計量資料以表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、SDX減輕DM小鼠視網膜滲漏

Con+NS組、Con+SDX組視網膜微血管EB滲漏情況無差異，DM+NS組視網膜微血管EB滲漏較Con+NS組明顯，DM+SDX組視網膜微血管EB滲漏情況優于DM+NS組，見圖1A。

EB的定量檢測結果顯示，DM+NS組、DM+ SDX組視網膜微血管EB滲漏量均高于其余2組（F = 34.890，P < 0.001），但DM+SDX組視網膜微血管EB滲漏量少于DM+NS組（P < 0.05）。

二、SDX減輕高糖誘導的NLRP3炎癥小體在HRMEC中的表達增加

高糖組NLRP3炎癥小體成分較低糖組高，加入1.0 lsu/ml的SDX處理后，NLRP3炎癥小體相關蛋白表達下調，抑制程度隨SDX濃度的增加而增加（P均< 0.05），見圖2。

三、SDX降低糖尿病小鼠視網膜和高糖誘導的HRMEC中的NLRP3炎癥小體的表達和激活

糖尿病小鼠NLRP3炎癥小體激活增加，注射SDX后NLRP3、ASC和Caspase-1的表達和共定位相對注射生理鹽水的小鼠均有所減少，見圖3A、 B。

高糖刺激的HRMEC中NLRP3炎癥小體激活增加，加入SDX處理后，NLRP3、ASC和Caspase-1的表達和共定位減少。

討 論

DR作為糖尿病常見的微血管并發癥之一，已成為成人致盲的首要疾病[11]。我國2013年的研究調查顯示，成年人群的糖尿病患病率為10.4%，其中DR的發病率高達23.0%[12-13]。了解DR的發病機制，尋找無創、有效的治療手段對于治療因為DR導致的成年人失明具有極其重要的意義。糖胺聚糖是人體中含量最豐富的多糖，由重復的二糖片段構成，主要分布在細胞外基質或細胞的表面，可以為細胞提供支撐。SDX屬于糖胺聚糖，多項臨床和基礎研究證實SDX具有內皮細胞保護作用[7， 14-16]。我們課題組前期的研究顯示，SDX對高糖誘導的HRMEC功能紊亂具有保護作用，可以減輕高糖導致的炎癥反應[8]。本研究結果顯示，在DM + NS組小鼠的視網膜微血管中，EB滲漏情況嚴重，而DM + SDX組幾乎未見滲漏，表明SDX改善了糖尿病引起的視網膜微血管滲漏情況。另外，視網膜組織裂解液中的EB的吸光度檢測結果也表明SDX可以減輕糖尿病小鼠視網膜的滲漏。

研究顯示，NLRP3炎癥小體的激活在糖尿病小鼠的視網膜和高糖刺激的HRMEC中均上調[5-6， 17]。在內皮細胞中高糖誘導的氧化應激可以導致NLRP3炎癥小體的激活，并參與DR的發病[18-20]。本研究顯示，在糖尿病小鼠的視網膜和高糖處理后的HRMEC中，NLRP3炎癥小體成分的表達和激活均有上調，這提示NLRP3炎癥小體在DR的發病過程中起重要作用。NLRP3炎癥小體的激活可以將Caspase-1切割為cleaved Caspase-1，本研究中高糖處理與低糖處理后的HRMEC中Caspase-1的表達比較差異無統計學意義，可能是由于上調的Caspase-1蛋白被切割為cleaved Caspase-1所致。

Giurdanella等[21]發現SDX可以通過下調NF-κB的激活來下調HRMEC中的ERK/cPLA2/COX-2/PGE2通路，改善HRMEC在高糖處理后的緊密連接蛋白減少。我們課題組的前期研究也進一步佐證了上述發現，即SDX下調HRMEC中的NF-κB磷酸化，從而減輕HRMEC的炎癥反應[8]。又有報道證實NLRP3炎癥小體的激活受PGE2調控[6]。因此，關于SDX如何抑制NLRP3炎癥小體的表達和活化，我們推測：SDX可能通過降低NF-κB的磷酸化，阻礙ERK/cPLA2/COX-2/PGE2通路，減少NLRP3炎癥小體組分的表達與激活，減輕DR的炎癥反應。

綜上所述，本研究首次在小鼠體內證實了SDX改善了DR視網膜微血管滲漏和視網膜的NLRP3炎癥小體的表達及活化，為SDX應用于臨床治療DR提供了進一步的證據。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-04-29）

（本文編輯：洪悅民）