高效拮抗鏈孢霉和綠色木霉海洋細菌的篩選及鑒定

李歡 曹雪梅 陳茹 吳海霞 王軍強 馬桂珍 暴增海 彭海

摘要：【目的】篩選用于防治食用菌污染菌鏈孢霉（Neurosporacrasa sp.）和綠色木霉（Trichoderma viride）的拮抗菌株，為食用菌病害的生物防治提供優良生防資源?！痉椒ā恳苑蛛x自江蘇連云港海域的92株海洋細菌菌株為研究對象，采用平板對峙法和打孔法測定供試菌株及其發酵液對鏈孢霉和綠色木霉的抑菌作用，測定抑菌作用較強菌株與杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌絲生長的相容性，篩選抑菌作用強且與杏鮑菇菌絲相容性好的優良拮抗菌株;通過形態特征觀察、生理生化試驗和16S rDNA、gyrB序列分析對優良拮抗菌株進行種類鑒定。【結果】從92株供試海洋細菌菌株中篩選出一株高效拮抗污染菌的BMY-2菌株，其對鏈孢霉的抑菌圈直徑達25.33 mm，對綠色木霉的抑菌帶寬度達30.00 mm，且與杏鮑菇的相容性好;分類鑒定結果表明，BMY-2菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。【結論】解淀粉芽孢桿菌BMY-2菌株對食用菌污染菌鏈孢霉和綠色木霉均具有較強的抑制作用，且與杏鮑菇生物相容性好，在食用菌生物防治上具有良好的潛在應用前景。

關鍵詞： 食用菌;鏈孢霉;綠色木霉;海洋細菌;解淀粉芽孢桿菌;生物防治

0 引言

【研究意義】鏈孢霉（Neurosporacrasa sp.）和綠色木霉（Trichoderma viride）是食用菌栽培過程中常見且危害嚴重的污染菌。鏈孢霉對香菇、杏鮑菇等多種食用菌的培養料、母種、原種、栽培種、栽培袋和子實體均能造成危害，其繁殖速度快，可在1～3 d內覆蓋食用菌培養料;其孢子可在菇房地面、墻壁和菇架上存活多年，且一旦污染很難徹底清除，常引起整批菌種或菌袋報廢，給食用菌生產造成較大的經濟損失（朱富春，2013;辛穎，2016）。綠色木霉主要存在于朽木、枯枝落葉、植物殘體和空氣中，幾乎所有的食用菌在不同生長階段均會遭受綠色木霉的侵染（吳曉金，2008;熊小龍，2011;邊銀丙，2013）。目前，食用菌生產過程中對污染菌的防治主要依靠化學農藥，如使用多菌靈、克霉靈、來蘇水、苯酚和巴斯消毒液等（江英成，2001;陳小麗，2009;張柳蓮等，2017），但化學防治容易導致環境污染、子實體農藥殘留、病原菌產生抗藥性等問題，且食用菌生長周期短，用藥后短期內采收上市易導致食用者急性中毒，因此，尋找替代化學防治食用菌污染菌的安全有效方法具有重要現實意義。【前人研究進展】生物防治可彌補化學防治的不足，在植物病害防治中已得到高度重視。生防細菌可產生細菌素、抗菌蛋白、脂肽類抗生素等產物，為細菌應用于食用菌的生物防治提供了理論依據（連燕萍，2016;楊勝清等，2017;張同睿，2018）。近年來，利用生防細菌防治食用菌病害的研究取得一定進展，有學者篩選出一些對食用菌污染菌具有明顯拮抗作用的優良菌株。吳小平等（2009）、孟文文等（2015）分別篩選出對鏈孢霉和3種木霉菌絲生長、產孢量及孢子萌發具有較強抑制作用，但對平菇菌絲生長抑制作用較弱的拮抗菌株——枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS-2和B4;林娓娓等（2011）篩選獲得5株對鏈孢霉有較強抑制作用的菌株;馬林等（2016）篩選出的假單胞菌（Pseudomonas sp.）MS82對綠色木霉具有明顯抑制作用，并發現該菌株產生抑菌物質的相關基因?，F有的生防制劑菌株主要來源于陸源微生物，但也有學者從海洋中篩選出多株具有強抑菌作用的優良海洋細菌，為海洋細菌應用于食用菌污染菌的控制提供了可能。本課題組從連云港海域分離得到放線菌（Actinomyces）BM-2（暴增海等，2013）、解淀粉芽孢桿菌GM-1-1（葛平華，2013）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）L1-9（馬桂珍等，2013）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）BMF 03（陳茹等，2018）等多株對植物病原菌具有廣譜抗菌作用的菌株;曲均革等（2018）、楊定祥等（2018）從海洋中篩選獲得的MB133和SH-27等菌株對辣椒疫霉（Phytophthera capsici）、水稻紋枯（Rhizoctonia solani）、稻瘟（Magnaporthe grisea）等多種植物病原菌具有較強的抑制作用，表現出良好的開發應用前景?！颈狙芯壳腥朦c】目前報道拮抗食用菌污染菌的優良菌株較少，而從海洋中獲得食用菌污染菌拮抗細菌的相關研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用平板對峙法和打孔法對保藏于淮海工學院海洋抗菌微生物研究室（以下簡稱本實驗室）的分離自江蘇連云港海域的海洋細菌進行篩選，以期獲得對鏈孢霉和綠色木霉有較強抑制作用且與食用菌相容性好的海洋細菌優良菌株;結合菌株形態特征、生理生化試驗、16S rDNA和gyrB序列分析結果對優良拮抗菌株進行鑒定，明確菌株的分類地位，為食用菌污染菌的生物防治提供新型優良菌株。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 92株海洋細菌菌株由本實驗室從連云港海域分離獲得并保藏，鏈孢霉和綠色木霉由本實驗室從連云港恒潤食用菌有限公司菇房污染菌袋中分離純化獲得，生理生化試驗對照菌大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由本實驗室保藏提供。

1. 1. 2 培養基 海洋細菌和供試真菌的活化、平板對峙試驗及細菌菌落特征觀察培養基為PDA培養基，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養基為牛肉膏蛋白胨培養基。

1. 2 鏈孢霉和綠色木霉拮抗菌株篩選

1. 2. 1 海洋細菌不同菌株對鏈孢霉和綠色木霉菌絲生長的抑制作用 采用平板對峙法測定92株海洋細菌菌株對鏈孢霉和綠色木霉的抑制作用。在PDA培養基平板中央接種鏈孢霉或綠色木霉，將鏈孢霉于28 ℃培養14 h或綠色木霉在28 ℃培養48 h，用打孔器取直徑5 mm的鏈孢霉或綠色木霉菌菌苔接種于新的PDA培養基平板中央，在距離菌苔15 mm處等距離接種不同細菌菌株，以不接種細菌為對照，28 ℃恒溫倒置培養1～3 d，測量不同海洋細菌菌株對鏈孢霉的抑菌圈直徑和對綠色木霉的抑菌帶寬度，每個菌株3次重復。比較不同海洋細菌菌株的抑菌作用。

1. 2. 2 海洋細菌不同菌株發酵液對鏈孢霉和綠色木霉菌絲生長的抑制作用 將抑菌作用較強的不同海洋細菌菌株分別接種到裝有60 mL PD培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩培養52 h。發酵液于4 ℃下8000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm的細菌過濾器過濾得到無菌發酵液。采用打孔法測定不同菌株發酵液對鏈孢霉和綠色木霉的抑制作用。在PDA培養基平板中央接種直徑5 mm已培養14 h的鏈孢霉或培養48 h的綠色木霉菌菌苔，在距病原菌15 mm處等距離用直徑8 mm的打孔器打孔，每孔分別加入150 μL不同菌株的無菌發酵液，以等量PDA培養基為對照，28 ℃恒溫培養，測量不同菌株無菌發酵液對鏈孢霉的抑菌圈直徑和對綠色木霉的抑菌帶寬度，每個菌株3次重復。

1. 2. 3 海洋細菌不同拮抗菌株與杏鮑菇的相容性測定 選取對鏈孢霉和綠色木霉有較強抑制作用的海洋細菌菌株，采用平板對峙法測定海洋細菌菌株與杏鮑菇菌絲的相容性。方法同1.2.1，28 ℃恒溫持續培養10 d，觀察杏鮑菇菌絲生長狀況。

1. 3 優良拮抗菌株種類鑒定

1. 3. 1 形態特征觀察 將優良拮抗菌株接種至PDA培養基上培養48 h，觀察優良拮抗菌株菌落形態、大小和顏色，菌落表面隆起程度、邊緣的生長狀況、光澤度及透明度;在光學顯微鏡下觀察菌株細胞形態，對菌株進行革蘭氏染色、莢膜染色、芽孢染色和鞭毛染色，觀察結果。

1. 3. 2 生理生化試驗 生理生化試驗以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）和《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）中的方法，測定優良菌株M.R.試驗、V-P試驗、硫化氫試驗等21項生理生化指標。

1. 3. 3 優良拮抗菌株的16S rDNA和gyrB序列分析 細菌基因組DNA用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌基因組DNA快速抽提試劑盒按步驟提取。采用細菌16S rDNA序列通用引物進行擴增。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸7 min。采用1%瓊脂糖對PCR擴增產物進行檢測。將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果提交NCBI數據庫，采用BLAST程序與數據庫中菌株序列進行比對，采用MEGA 7.0構建系統發育進化樹。

若通過16S rDNA序列分析不能準確進行種類鑒定，則繼續采用gyrB序列分析。gyrB序列擴增引物序列為UP1：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTG CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3';UP2r：5'-AGCA GGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGC RTC NGTCAT-3'（劉國紅，2009）。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖對PCR擴增產物進行檢測。擴增產物測序及比對同16S rDNA序列分析。

2 結果與分析

2. 1 鏈孢霉和綠色木霉拮抗菌株的篩選結果

2. 1. 1 海洋細菌不同菌株對鏈孢霉和綠色木霉菌絲生長的抑制作用 平板對峙試驗結果顯示，92株供試海洋細菌菌株中有79株菌株對鏈孢霉有抑制作用，其中27株菌株的抑菌圈直徑在20.00 mm以上，以HG-1菌株的抑制作用最強，抑菌圈直徑為26.67 mm;73株菌株對綠色木霉有抑制作用，其中70株菌株的抑菌帶寬度在20.00 mm以上，以BMY-2菌株的抑制作用最強，抑菌帶寬度為30.00 mm。69株菌株對2種病原菌均具有一定的抑制作用，其中，HG-1菌株對鏈孢霉的抑制作用最強，但對綠色木霉的抑制作用較弱;BMY-2菌株對鏈孢霉和綠色木霉均具有較強的抑制作用，抑菌圈直徑和抑菌帶寬度分別為25.33和30.00 mm（表1）。

2. 1. 2 海洋細菌不同菌株發酵液對鏈孢霉和綠色木霉菌絲生長的抑制作用 選取52株對鏈孢霉和綠色木霉具有抑制作用的海洋細菌進行菌株發酵液抑菌作用測定，其中有43株菌株發酵液對鏈孢霉和綠色木霉均具有抑制作用。由表2可知，52株菌株中有15株菌株發酵液對鏈孢霉的抑菌圈直徑在16.00 mm以上;有46株菌株發酵液對綠色木霉的抑菌帶寬度在20.00 mm以上;BMY-2菌株發酵液對鏈孢霉和綠色木霉的菌絲生長均具有較強抑制作用，對應的抑菌圈直徑和抑菌帶寬度分別為17.00和22.00 mm（圖1）。

2. 1. 3 拮抗菌株與杏鮑菇的相容性測定結果 選取15株對鏈孢霉和綠色木霉均具有較強抑制作用的菌株與杏鮑菇進行相容性測定，結果顯示，BMY-2、ZA-1和SH-7等10株菌株與杏鮑菇對峙培養6 d時，杏鮑菇菌絲生長緩慢，有輕微抑制現象;培養第8 d后，杏鮑菇菌絲生長恢復正常，逐漸覆蓋細菌菌落，表明對杏鮑菇的生長無明顯影響（圖2）;NT-3、WF-1、HG-3、W8-3和SC-2菌株培養10 d對杏鮑菇的菌絲生長有一定抑制作用，抑菌帶寬度大于8.00 mm（表3，圖3）。

結合抑菌試驗結果，BMY-2菌株及其發酵液對鏈孢霉和綠色木霉均具有較強的抑制作用，且對杏鮑菇菌絲生長無明顯影響，可作為防治食用菌污染菌鏈孢霉和綠色木霉的優良菌株。

2. 2 優良拮抗菌株的種類鑒定

2. 2. 1 形態特征觀察 BMY-2菌株在PDA培養基上培養24 h，其菌落呈圓形、隆起、乳白色，邊緣不整齊、表面濕潤，培養48 h后菌落顏色加深，菌落表面出現褶皺。細胞呈桿狀，G+，有芽孢，芽孢中生，無鞭毛，有莢膜（圖4）。

2. 2. 2 生理生化試驗 BMY-2菌株可利用葡萄糖、蔗糖和果糖，不利用麥芽糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇和肌醇;淀粉水解試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、氧化酶試紙試驗均呈陽性，半固體瓊脂和M.R.試驗呈陰性（表4）。

根據形態特征觀察和生理生化試驗結果，查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984），并參考劉國紅（2009）芽孢桿菌的分類鑒定文獻，BMY-2菌株的特性與芽孢桿菌屬（Bacillus）一致，初步判斷BMY-2菌株為芽孢桿菌屬。

2. 2. 3 BMY-2菌株16S rDNA序列分析 以菌株基因組DNA為模板，利用16S rDNA擴增的通用引物進行擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，擴增產物約1500 bp，符合16S rDNA序列大小，測序結果為1454 bp。

菌株16S rDNA序列在GenBank中進行比對分析，結果顯示BMY-2菌株與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）的相似性均在98%以上，采用MEGA 7.0構建系統發育進化樹，結果（圖5）發現BMY-2菌株與Bacillus subtilis C11-5、B. amyloliquefaciens ZW05和Bacillus velezensis Tr02M等菌株在同一分支上，但同源性較低，說明通過16S rDNA序列分析未能準確將菌株鑒定到種的水平。

2. 2. 4 BMY-2菌株gyrB序列分析 以BMY-2菌株基因組DNA為模板，利用gyrB擴增引物進行擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1300 bp的PCR擴增產物，符合gyrB序列大小，測序結果為1203 bp。BMY-2菌株的gyrB序列在GenBank中進行比對分析，發現BMY-2菌株gyrB序列與B. amyloliquefaciens的相似性達99%。

采用MEGA 7.0構建系統發育進化樹，結果（圖6）顯示，BMY-2菌株與B. amyloliquefaciens chenj-1菌株在同一分支上，且同源性達99%。

根據細菌形態特征觀察、生理生化試驗結果、16S rDNA序列分析和gyrB序列分析結果，可確定BMY-2菌株為解淀粉芽孢桿菌。

3 討論

本研究發現92株供試海洋細菌菌株中有69株菌株對食用菌污染菌鏈孢霉和綠色木霉均具有一定的抑制作用，可能因為供試菌株為本實驗室篩選出的可用于防治植物病害的生防細菌，植物病原真菌與鏈孢霉和綠色木霉同為真菌，大多數供試菌株對真菌具有廣譜抗性。優良拮抗菌株與杏鮑菇的相容性試驗結果表明，部分抑菌效果較好的菌株對杏鮑菇菌絲生長也有一定抑制作用，但抑制作用較小，與吳小平等（2009）、孟文文等（2015）的研究結果一致，其原因主要是鏈孢霉、綠色木霉和食用菌均為真菌，生防細菌產生的抑菌物質對病原菌和食用菌的生長均具有抑制作用。因此，需進一步從生防菌中篩選對食用菌影響小而對病原菌靶標性強的優良菌株，或采用生物技術改造優良生防細菌，使其對污染菌的抑制作用強而對食用菌無影響。

解淀粉芽孢桿菌是生防細菌的重要一員，連燕萍（2016）、陳嘉敏等（2018）、段海明等（2018）、王雪等（2019）、張瑩等（2019）研究發現解淀粉芽孢桿菌能產生抗菌蛋白和脂肽類抗菌物質，可在黃瓜和人參等植物中定殖，并在一定程度上誘導植株產生抗病性。本研究篩選出的海洋解淀粉芽孢桿菌BMY-2菌株生長環境不同于陸源解淀粉芽孢桿菌，海洋環境溫度較低，鹽分高，其不僅能在普通土壤中生長，還能適應寡營養、高鹽分的鹽堿地區，因此該菌株的應用范圍更加廣闊，且定殖能力較強。但該菌株的抑菌作用機理尚不明確，推測其通過產生抑菌物質抑制病原菌孢子萌發、破壞病原菌菌絲而防治食用菌病害。此外，由于海洋環境的特殊性，可能該海洋細菌產生抑菌物質中存在不同于陸源解淀粉芽孢桿菌的抑菌物質。在本研究基礎上，還應進一步研究BMY-2菌株的生長特性及發酵工藝，以提高BMY-2菌株的發酵水平，為該菌株應用于食用菌病害生物防治提供理論依據;同時，該海洋解淀粉芽孢桿菌用于食用菌病原菌的抑菌防病機理也有待進一步探究。

4 結論

篩選獲得的海洋細菌BMY-2菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），該菌株對鏈孢霉和綠色木霉均具有較好的抑制效果，且對杏鮑菇菌絲生長無明顯影響，是一株優良的生防細菌，在杏鮑菇等食用菌鏈孢霉和綠色木霉污染的生物防治上具有較好的應用前景。

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（責任編輯 麻小燕）