桑毛色二孢根腐病菌遺傳多樣性的ISSR分析

謝紅輝 王麗 萍黃顯雅 李菊馨

摘要：【目的】明確來源于廣西各地桑樹根腐病病原菌可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae Pat.）的遺傳多樣性特征，為桑樹抗病育種提供參考依據。【方法】以從廣西各桑樹種植區采集、分離的44株L. theobromae菌株為材料，利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取參試菌株的基因組DNA;從加拿大哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列中隨機選擇60條引物先對8株菌株的DNA進行預擴增，選用擴增條帶數量多、條帶清晰的引物對所有參試菌株的DNA進行擴增，統計每條引物的擴增條帶數形成0、1矩陣;利用NTSYSpc（Version 2.10e）計算不同菌株間的遺傳相似系數，采用非加權組平均法構建系統發育聚類圖，并進行聚類相關分析;利用PopGene（Version 1.32）分析不同地理來源和寄主來源菌株的遺傳分化程度。【結果】ISSR分子標記結果顯示，44株參試菌株（7個居群）的多態位點百分率在92.00%以上;7個居群的平均遺傳一致度（IN）和平均遺傳距離（D）分別為0.7363和0.3108;44株參試菌株的平均基因多樣性指數（H）和Shannon’s信息指數（I）分別為0.3263和0.4841，均高于7個居群的平均值（0.1256和0.1796）;對應的遺傳分化系數（Gst）、基因流值（Nm）分別為0.6142和0.3141。【結論】廣西地區桑毛色二孢根腐病菌菌株具有較高的多態性，菌株間的遺傳多樣性高于居群，遺傳多樣性與菌株的地理來源有關。

關鍵詞： 桑樹;根腐病;可可毛色二孢;ISSR;廣西

0 引言

【研究意義】目前廣西的桑樹種植面積達20.06萬ha，是我國蠶繭生產第一大省（區）和世界重要原料繭生產基地（何雪梅等，2017）。真菌類病害是我國桑樹的主要病害，其中與子囊菌亞門真菌有關的真菌病害有50多種（蒲冠勤等，2012;謝紅輝，2016）。可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae Pat.）是一種多型性土傳真菌，在全世界廣泛分布（Sreerama and Singh，2009）。L. theobromae的寄主植物有500多種，在相同或不同植物上引起的病害癥狀多種多樣（胡美姣等，2012;Safdar et al.，2015）。2014年，我國首次報道L. theobromae在廣西橫縣侵染桑樹根部引起根腐病（Xie et al.，2014），目前生產上尚缺乏防治桑毛色二孢根腐病的有效藥劑。抗病育種是防治植物病害的一種有效途徑，而研究病原菌的遺傳多樣性對于開展抗病育種工作具有重要意義。【前人研究進展】Nghia等（2012）利用ISSR分子標記研究來自橡膠樹的20株Botryodiplodia theobromae（L. theobromae的異名）菌株的遺傳多樣性，發現參試菌株的ISSR類群劃分與菌株的地理來源有關。Tan等（2012）利用篩選出的4條ISSR引物對20株L. theobromae菌株進行分子標記，共擴增出483條DNA條帶，其中126條為多態性條帶，多態率為29.9%;聚類分析結果顯示，所有菌株被分為9個類群，基因型與地理來源無關。陳小莉（2015）研究了芒果蒂腐病菌的遺傳多樣性，發現群體間遺傳多樣性豐富，菌株的聚類與菌株的地理來源和致病力無關聯。Qiu等（2015）利用ISSR分子標記研究了葡萄座腔菌科Diplodia seriata、Neofusicoccum parvum、Botryosphaeria dothidea和L. theobromae 4個種不同地理來源的171株菌株的遺傳多樣性和遺傳分化，結果表明同一地理來源的菌株遺傳差異明顯。【本研究切入點】前人研究結果顯示，L. theobromae菌株的遺傳多樣性或與菌株的地理來源有關。桑毛色二孢根腐病作為我國桑樹生產上一種嚴重發生的新病害，但其病原菌的遺傳多樣性和遺傳分化規律是否與菌株的地理來源有關尚需進一步驗證。【擬解決的關鍵問題】采用ISSR分子標記分析來自廣西不同桑樹種植區的根腐病病菌L. theobromae菌株的遺傳多樣性，利用NTSYSpc和PopGene分析計算菌株的遺傳相似系數和遺傳分化相關參數值，采用非加權組平均法構建系統發育聚類圖，并進行聚類相關分析，以明確菌株間的遺傳分化情況及其與菌株地理來源間的關系，為開展桑樹抗病育種等病害防治研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 供試菌株

菌株由本課題組從廣西橫縣、鹿寨和宜州等地的桑毛色二孢根腐病病株根部組織分離，并通過柯赫氏法則驗證、測定菌株的ITS序列和EF1-α序列鑒定所得（表1）。表1中L. theobromae菌株的ITS和EF1-α序列均已在NCBI中注冊提交，且分別與已發表的L. theobromae代表菌株CBS 164.96（Phillips et al.，2005）的ITS序列（登錄號AY640255）和EF1-α序列（登錄號AY640258）同源性達99%。

1. 2 菌株DNA提取與檢測

利用真菌基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.? Fungal DNA Min Kit，OMEGA公司生產）提取參試菌株的基因組DNA，按照試劑盒操作說明進行提取。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的菌株基因組DNA質量，并用核酸濃度測試儀測定其濃度后貯存于-20 ℃冰箱，備用。

1. 3 ISSR遺傳多樣性分析

1. 3. 1 ISSR引物篩選 從加拿大哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列中隨機選取60條引物（周延清，2005），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。先用60條ISSR引物對不同地理來源和不同寄主的8株菌株DNA模板進行擴增，以篩選出有較多條帶、條帶多態性及重復性好的引物。再用篩選出的引物對44株供試菌株進行ISSR PCR指紋圖譜分析。

1. 3. 2 ISSR PCR反應及電泳 反應體系25.0 μL：30 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L引物1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火溫度42～48 ℃（退火溫度根據引物設定），退火時間45 s，72 ℃ 2 min，進行45個循環;72 ℃延伸15 min。

PCR擴增產物檢測：配制1.8%瓊脂糖膠，待瓊脂糖膠的溫度冷卻至60 ℃左右時，根據瓊脂糖膠的體積按比例加入一定量的核酸染料，輕輕搖勻后倒入制膠板內。待膠板完全凝固后，取5.0 μL PCR反應產物點樣。電泳（100 V，80 mA）3.5 h后，將膠板移至UVItec?凝膠成像系統上觀察PCR產物電泳結果并拍照。

1. 4 數據處理

觀察各引物對每株菌株的擴增電泳圖譜，統計每條引物的擴增條帶數，記錄條帶（有條帶的記為1，無條帶的記為0），形成0、1矩陣。利用NTSYSpc （Version 2.10e）計算不同菌株間的遺傳相似系數，采用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構建系統發育聚類圖，并進行聚類相關分析。利用PopGene（Version 1.32）分析不同地理來源和寄主來源菌株的遺傳分化程度。多態率計算公式：

多態率（%）=多態性條帶數擴增條帶數×100

2 結果與分析

2. 1 引物篩選結果

利用60條ISSR引物擴增8株菌株的DNA模板，從中篩選出10條擴增條帶清晰、條帶數多、重復性好的引物（表2）。

2. 2 ISSR擴增結果

利用篩選出的10條引物對44株菌株DNA目標進行擴增，共標記出109條DNA條帶，條帶大小介于250～3000 bp，其中多態性條帶有101條，多態率為83.33%～100.00%，平均多態率為92.66%。其中，以引物HBH（AG）7擴增的條帶數最多（圖1），達13條，多態性條帶為12條，多態率92.31%。

2. 3 ISSR標記的菌株聚類分析結果

采用NTSYSpc 2.10e統計ISSR標記的數據，計算遺傳相似系數，并用UPGMA構建系統發育聚類圖（圖2）。聚類圖中，遺傳相似系數越小，表明菌株間親緣關系越遠;遺傳相似系數越大，表明菌株間親緣關系越近。圖2顯示，來源于不同地理來源的44株L. theobromae菌株被劃分為7個居群（表1），遺傳相似系數在0.65～1.00，平均為0.83。當聚類圖以遺傳相似系數0.77（L虛線）為閾值時，所有菌株分別處在6個分支上。其中，來自融安（LR）和蒙山（WM）的菌株聚在一起，其他居群的菌株分別獨立聚在一個分支上。44株L. theobromae菌株的ISSR標記聚類結果表明，參試菌株的遺傳多樣性水平與菌株的地理來源有很大的相關性，不同地理來源的菌株，其遺傳相似性低，遺傳分化程度高。

2. 4 基于ISSR標記的菌株群體遺傳分化分析結果

利用PopGene計算各居群的遺傳距離（D）和Nei’s遺傳一致度（IN），結果（表3）顯示，7個居群的遺傳一致度為0.5702～0.8239，平均為0.7363;遺傳距離為0.1938～0.5618，平均為0.3108。7個居群中，宜州（HY）居群的L. theobromae菌株群體和蒙山（WM）居群的L. theobromae菌株群體的遺傳距離最遠（D為0.5618），遺傳一致度最低（IN為0.5702），說明這2個居群間的遺傳分化程度最高，親緣關系較遠;而橫縣（NH）居群的L. theobromae菌株群體和象州（LX）居群的L. theobromae菌株群體遺傳一致度最高（IN為0.8239），遺傳距離最短（D為0.1938），說明這2個居群間的遺傳分化程度低，親緣關系較近。

2. 5 基于ISSR標記的菌株群體多樣性分析結果

利用PopGene對7個居群的遺傳多樣性參數進行分析，結果（表4）顯示，7個居群的平均多態位點數（Pl）為25.57個，平均多態位點百分率（Ppl）為28.73%，平均觀察等位基因數（Na）為1.2873，平均有效等位基因數（Ne）為1.2325，平均基因多樣性指數（H）為0.1256，平均Shannon’s信息指數（I）為0.1796。其中，NH居群的Pl最多，達42.00個，Ppl為47.19%;WM居群的Pl和Ppl最低。居群內的遺傳多樣性以LL居群的菌株最高，其I為0.2973，LR居群的I最低，為0.0618。

由表5可知，參試的44株L. theobromae菌株在種級水平的Na為1.8989，Ne為1.5689，H為0.3263，I為0.4841，菌株的總雜合度（Ht）平均為0.3255，種水平遺傳雜合度（Hs）為0.1256，遺傳分化系數（Gst）平均為0.6142，基因流（Nm）為0.3141。

對經比表4和表5中各項遺傳多樣性參數可知，居群內菌株的平均H（0.3263）和I（0.4841）均高于居群間的平均H（0.1256）和I（0.1796），說明居群內的遺傳豐富多樣，遺傳分化程度高于7個居群間的遺傳分化程度，菌株的遺傳多樣性程度較高。

3 討論

研究表明，部分真菌菌株的遺傳多樣性與菌株的地理來源無相關性，也有部分真菌的遺傳多樣性與菌株的地理來源間存在一定聯系。Shah等（2010）研究了來源于印度梨樹的30株L. theobromae菌株遺傳多樣性，發現來自不同地理來源的菌株間遺傳多樣性豐富，而來自同一地理來源的菌株遺傳相似性高。Nghia等（2012）利用ISSR分子標記分析了來自橡膠樹的20株B. theobromae菌株的遺傳多樣性，16條引物共標記出214條DNA條帶，多態性條帶為164條，平均多態率為76.6%;UPGMA聚類結果顯示，20株菌株被分為4個不同類群，類群劃分與菌株的地理來源有關。Prajapati和Patil（2015）的研究表明，9株來自印度不同麻風樹栽培地區的L. theobromae菌株被分為兩個類群，該類群劃分與菌株的地理來源無顯著聯系。Qiu等（2015）利用ISSR分子標記研究了葡萄座腔菌科Diplodia seriata、Neofusicoccum parvum、B. dothidea和L. theobromae 4個種不同地理來源的171株菌株遺傳多樣性和遺傳分化，結果發現同一地理來源的L. theobromae菌株間存在明顯遺傳變異。本研究中來源于廣西不同桑樹種植區的44株L. theobromae菌株被劃分為7個居群，UPGMA聚類顯示居群劃分與地理來源有關，與Nghia等（2012）的研究結果相似;本研究ISSR分子標記結果顯示菌株間的遺傳多樣性豐富，菌株間的遺傳分化水平顯著高于居群的遺傳分化水平，與Qiu等（2015）的研究結果相似。

Burgess等（2003）研究了來自桉樹、松樹和麻黃屬植物的L. theobromae菌株遺傳多樣性，發現菌株的SSR類群劃分與寄主具有緊密關系。廣西是我國的桑樹種植大省（區），各市縣種植的桑樹品種較多且不盡相同（謝紅輝等，2016）。本研究中的試驗菌株主要在冬季采樣分離獲得，采樣時桑樹已經落葉完畢，很難辨認其品種，因此菌株的寄主必然包含有不同的桑樹品種。但L. theobromae作為桑毛色二孢根腐病的病原菌，其遺傳分化水平是否與不同桑樹品種有關尚需進一步驗證。

群體間的遺傳變異程度用遺傳變異系數（Gst）表示，當遺傳變異系數值在0.15以上時，遺傳分化主要表現于群體內（Chen et al.，2015）。基因流即基因在群體中運動，指某群體的部分個體遷移到另一群體時會把某基因帶入新群體，從而產生基因流動，基因流越大，群體間的相似性越大;基因流動是影響群體與群體、群體內部不同個體間遺傳變異水平的重要因素（曲若竹等，2004）。群體間的Nm小于1，有限的基因流會促使群體發生遺傳分化;而Nm大于1，則會阻止群體間發生遺傳分化（楊光偉等，2003）。Mohali等（2005）分析了來自不同地理和寄主的L. theobromae菌株的基因流動和種群遺傳多樣性，發現L. theobromae在針葉樹和闊葉樹的不同種寄主間有較強的基因流動，說明寄主間的菌株遺傳相似性高，而來源于委內瑞拉、墨西哥和南非的L. theobromae種群具有一定遺傳距離。墨西哥、委內瑞拉和南非居群的基因流動頻繁，可能是由于委內瑞拉和南非等亞熱帶國家的松樹種子來源于墨西哥，而墨西哥種子中的一些優勢菌株的基因型在其他國家或地區廣泛繁殖。Al-Sadi等（2013）研究了來自阿曼和阿聯酋椰棗、柑橘和芒果樹的64株L. theobromae菌株的遺傳多樣性，AFLP聚類分析結果顯示所有菌株被分為4個類群，分子方差（AMOVA）分析結果顯示來自芒果、柑橘和椰棗上的L. theobromae遺傳分化程度低。這可能是由于阿曼和阿聯酋兩國間頻繁交換種植材料，寄主上的L. theobromae菌隨著種植材料的頻繁交換而不斷發生基因流動。本研究中，44株L. theobromae菌株間的Gst值（0.6142）大于0.15，而Nm（0.3141）小于1，進一步說明居群間的遺傳變異程度低，而菌株間的遺傳變異程度較高，遺傳分化大，遺傳多樣性豐富。

4 結論

廣西地區桑毛色二孢根腐病菌菌株具有較高的多態性，菌株間的遺傳多樣性高于居群，遺傳多樣性與菌株的地理來源有關。

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（責任編輯 麻小燕）