PCR法鑒別市售牛肉及其制品中的摻假情況分析

牛肉及其制品因其營養豐富，深受人們的喜愛。不法商販用相對廉價的馬肉、豬肉、鴨肉等肉類原料，通過各種手段加工，冒充牛肉、羊肉制品進行銷售以謀取不當利益，從而嚴重侵犯消費者的合法權益。聚合酶鏈式反應（ polymerase chain reaction，PCR） 是一種使特定核酸片段在體外大量復制的技術，利用這一技術，可以讓目標物種的特異DNA片段進行大量復制而進行檢測，以鑒別肉制品中是否摻入其他物種。相比于其他檢測手段，PCR檢測技術具有特異性好，靈敏度高等優勢，可以準確地為政府監管提供有利證據。本文對在各大菜市場和超市購買的牛肉及其制品中牛、豬、鴨成分進行了檢測，并根據檢測經驗對鮮牛肉的清洗樣和血水進行取樣檢測，對檢測結果進行了結果分析和總結，為摻假牛肉檢測技術提供理論和技術支撐，提高檢測人員對肉類檢測技術的檢測和分析能力。

材料與方法

材料與試劑

鮮牛肉，牛肉制品均購自于南京市各大菜市場和超市。

DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0 、Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit、Real Time PCR Procine DNA Detection Kit、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mM）、PCR體系預混液Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）寶生物工程（大連）有限公司。

儀器和設備

PikoREAL 96 實時熒光定量PCR儀（96孔板）：美國賽默飛;ST 16R高速冷凍離心機：美國賽默飛;EPS 300電泳儀 Tanon;Universal GenoSens1800凝膠成像儀：上海勤翔;ABI 2720普通PCR儀。

DNA提取

對每個鮮牛肉樣品按照不同的部位和步驟取樣，分別取原樣，清洗樣（盡量取肉的中心位置，用自來水反復清洗），血水（浸出到包裝袋里的血水），對采得的樣品進行DNA提取，其中血水的DNA提取稱樣量為100mg。對牛肉卷等牛肉加工樣品直接取原樣進行DNA提取。DNA的提取均采用試劑盒的說明書方法步驟進行。

熒光定量PCR檢測

牛和豬的PCR反應體系均為：預混液20 μL，包括DNA模板0.8μL，2×Premix for Bovine（ Procine）10 μL，Primer Mix for Bovine（ Procine）0.8 μL，Probe Mix for Bovine（ Procine）0.8μL，加ddH2O補足20μL。PCR反應條件為：95℃預變性10 s;PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，進行40個循環。根據擴增曲線Ct值≤35.0視為檢出牛或豬成分。

鴨的PCR反應體系為：預混液20 μL，包括DNA模板1.6 uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 uL，上下游引物各0.4 uL，Probe 0.8 uL，加ddH2O補足20uL。反應條件為：95℃預變性30 s;PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。根據擴增曲線Ct值≤35視為檢出鴨成分。

結果與分析

對各大超市和菜市場購買的50批次鮮牛肉及牛肉制品等樣品進行牛、豬、鴨成分檢測，檢測結果如圖1。

由圖1可以看出，純牛肉為36例，占總數的72%。發現一例牛肉摻鴨肉，摻假肉占2%。牛肉中摻有豬血的樣品占6%，牛血不易采集，價格貴，且牛血味道難聞，不法商販為了增加牛肉的重量而使用豬血浸泡牛肉，以獲取更高的利潤。發現假肉為10例，且均為豬肉造假牛肉。其中純豬肉為3例，占總數的6%，豬肉之所以能華麗變身為“牛肉”，其中起最大作用的并不是“硼砂”，而是豬血，將事先準備好的豬血、豆粉、糖、鹽等混入已經絞碎成片的豬肉中攪拌，同時加入硼砂，經過均勻攪拌后，正規的豬肉就被加工成了外觀顏色鮮紅的“牛肉”;豬肉中摻牛

結論

本文對樣品的原樣、清洗樣（用自來水清洗）、血水進行取樣并提取DNA，檢測牛、豬、鴨三種成分，發現摻假情況多種多樣，有牛肉摻鴨肉，牛肉摻豬血，純豬肉，豬肉摻牛肉等摻假及造假情況，其中摻假率為2%，造假率為20%。在檢測過程中對樣品進行清洗，可以洗掉浸泡在肉組織中的血水，只對肉組織進行取樣分析，防止不法商販為了造假牛肉而用豬肉浸泡牛血冒充牛肉，對血水進行提取DNA檢測也是此目的。本文只是對日常過程中遇到的摻假案例進行了分析總結，在以后的工作中應多方面關注肉類摻假信息，提高物種鑒定技術，同時在檢測過程中，對樣品的取樣應觀察肉樣是否是整塊肉。如果不是整塊肉，應均勻取樣，且取樣品的紅肉部分;如果肉樣是整塊肉，則應取肉樣的中間部位，并進行多次清洗，把血水洗干凈，減少因血液浸泡而引起的誤判。

馬慧娟 ?江蘇省理化測試中心