乙醛脫氫酶2對肥胖大鼠心肌的影響

于曉涵

摘要：隨著國民生活水平的提高，高脂飲食伴隨的生活習慣逐漸成為大眾主流。研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2（ALDH2）是一種在心肌保護方面具有重要作用的醛類氧化酶，能夠改善心肌損傷和動脈粥樣硬化等。因此，該實驗通過高脂飲食構建肥胖大鼠模型，探討ALDH2和心肌保護間的關系。

關鍵詞：高脂飲食;心肌;乙醛脫氫酶2

1 前言

社會的不斷進步和發(fā)展，帶動了國民的物質(zhì)水平不斷提高。中國居民的膳食習慣正在向以高脂飲食為主的西方膳食模式轉(zhuǎn)變，特別是在大城市，這種現(xiàn)象更為顯著。伴隨著人們膳食金字塔的改變，一系列慢性病的發(fā)病率不斷攀升，尤其是長期進食高脂食物可以增加冠心病的發(fā)病率。流行病學資料顯示，中國城市居民冠心病死亡率高達88.71/10萬，以每年20%的速度增長。并且出現(xiàn)地區(qū)和性別差異，城市高于農(nóng)村，男性高于女性，在發(fā)達的沿海城市這種情況更為顯著[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由冠狀動脈血管變窄或被阻塞使得心肌缺氧或梗死而引起的心臟病，簡稱冠心病，又被稱為缺血性心臟病。過量攝入高脂食物后，會造成膽固醇和甘油三脂長期處于高水平狀態(tài)，容易使動脈發(fā)生粥樣硬化，引發(fā)心臟內(nèi)的血液供給不足，致使心肌受損，最終引發(fā)冠心病。由于高脂食物中含有較多的飽和脂肪酸，經(jīng)科學證實攝入飽和脂肪酸的量越多，冠心病的患病率就越大，二者呈正相關。冠心病已經(jīng)影響到人類的生活質(zhì)量，成為影響身體健康的首要危險因素。因此如何降低高脂飲食模式對冠心病的發(fā)病率是目前亟待解決的重要問題。

乙醛脫氫酶（ALDH）是醛脫氫酶中的一種，包含19個成員，每個成員由不同的染色體上基因編碼。ALDH一共包括三類，存在于線粒體上的乙醛脫氫酶2（ALDH2）是其中的第二類。ALDH2是一種重要的醛類氧化酶，具有脫氫酶和酯酶的功能，能夠催化乙醇的代謝產(chǎn)生乙醛并將其氧化為醋酸，然后將乙醛衍生物4-羥壬烯醛（4-HNE）氧化分解，生成無毒的酸，減輕活性氧和醛類氧化酶生成對細胞造成的損傷[2]。研究表明，ALDH2是不僅是酒精代謝的關鍵酶，還可以保護由氧化應激造成的細胞損傷。另有研究表明，在缺血再灌注損傷中，隨著ALDH2活性的提高，心梗出現(xiàn)的面積就越小，呈現(xiàn)反關系，證實ALDH2具有改善心臟功能，保護心肌的重要作用。目前關于冠心病與ALDH2的基因多態(tài)性之間的關系有很多研究。從它的生物學特性來看，ALDH2基因的12 號外顯子的鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰蕰r，此時谷氨酸被替換為賴氨酸，根據(jù)該突變，ALDH2基因型在人群中就形成了3種組合方式：GG型（野生純合子）、GA型（雜合子）和AA型（突變純合子）。國內(nèi)外在這兩者的關系上有大量研究，有研究者選取了89名心梗患者和142名不穩(wěn)定型心絞痛患，把231名患者分為ALDH2*1/ALDH2*1型（n=145）和ALDH2*1/ALDH2*2，ALDH2*2/ALDH2*2型（n=86）兩組，結果發(fā)現(xiàn)突變型患者心梗發(fā)病率高于野生型患者。日本的一項研究顯示，ALDH2突變基因型成為了日本男性心梗的危險因素之一。但是進一步研究顯示，ALDH2的突變型基因只是心梗發(fā)生的主要危險因素，與冠狀動脈損傷的嚴重等級沒有關聯(lián)。研究提示，存在ALDH2*2等位基因的人患冠心病的風險更高，并且攜帶ALDH2*2的基因是心肌梗死和急性冠脈綜合癥中的主要危險因子，可能與ALDH2 活性降低后導致體內(nèi)脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)合成受阻、活性氧增加等因素有關，不過具體的機制尚未明確。在既往的研究中顯示，ALDH2活性的提高可以減慢動脈粥樣硬化的進展，減輕乙醇對肝臟的損傷，減弱氧化應激反應的發(fā)生，對酒精中毒可以起到解毒和治療的作用。總結以上探究，ALDH2與心血管疾病密切相關，如冠心病，缺血再灌注損傷等。所以研究ALDH2在心血管疾病治療方面的作用具有很重要的臨床價值。

本實驗擬通過高脂飲食構建肥胖大鼠模型，同時結合血清中總膽固醇（TC）和肌酸激酶（CK）的變化，探討ALDH2和心肌保護間的關系，為臨床降脂和心肌保護提供一定的實驗數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠雄性24只，2月齡，體重約290g。購于湖北實驗動物研究中心。所有大鼠均自由進食，室溫 21±4攝氏度下飼養(yǎng)。

2.1.2儀器和試劑

其林貝爾脫色搖床;垂直電泳槽1.5MM標配;VE-180轉(zhuǎn)移電泳槽;高壓電泳儀電源;多功能酶標儀;超級恒溫水浴鍋;小型冷凍高速離心機;電磁攪拌器;上海勤翔超敏熒光及化學反應儀;超聲波細胞粉碎機;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng);制冰機。由武漢萬知生物有限公司提供BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒;南京建成生物有限公司提供總膽固醇和肌酸激酶試劑測試盒。

2.1.3 取材

在干預后用戊巴比妥鈉麻醉后，取心肌組織于-80℃冰箱中冷凍。通過眼球取血5ml靜置30min后放于4℃冷柜過夜，隔天用1000轉(zhuǎn)/分鐘*10分鐘的模式進行離心，離心后取上層血清保存于-20℃的低溫環(huán)境中。

2.2方法

2.2.1高脂乳劑的配制

取500ml規(guī)格的燒杯，將20g豬油放在燒杯中用磁力攪拌器加熱到100℃后，加入2g膽固醇，用玻璃棒不斷攪拌使其熔化，再加入2g膽酸鈉攪拌使其溶解。再取一個500ml規(guī)格的燒杯，把20ml吐溫-80和20ml丙二醇倒入燒杯中用磁力攪拌器加熱至60℃，然后加入1g丙硫氧嘧啶。等到丙硫氧嘧啶充分溶解后，將兩個燒杯中的液體混勻。

2.2.2實驗分組

適應性飼養(yǎng)一周后的大鼠隨機抽取8只作為普食對照組（ND）提供標準飼料，另外16只給予高脂乳劑。并再將其隨機分為兩組，即高脂對照組（持續(xù)灌高脂乳劑，HR）、飲食限制組（DR，前四周喂食高脂乳劑，后四周喂食標準飼料）。八周后進行取材。

2.2.3 總膽固醇指標檢測

南京建成公司試劑盒提供的酶標儀測試方法：在空白孔，標準孔和校準孔中分別加入2.5微升的雙蒸水，標準品和樣本;接著將所有孔中加入250微升的工作液;混勻96孔板中各孔的液體;37℃孵育10分鐘;用酶標儀設置510nm的參數(shù);依據(jù)公式計算吸光度。

2.2.4 肌酸激酶活力測試

南京建成公司試劑盒提供的酶標儀測試方法：測定管中加入20微升的待測樣本;接著將300微升的混合試劑分別加入測定管和對照管中;振蕩混勻，37攝氏度，水浴20分鐘。水浴之后，在對照管中加入20微升的待測樣本，接著把試劑六分別加入兩種管里，振蕩混勻，每分鐘500轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)10分鐘，取上清加入定磷劑。混勻兩個管中的液體，浴調(diào)至45℃加熱15分鐘。雙蒸水調(diào)零設定參數(shù)660nm，測各管的吸光度。

2.2.5 Western blot法測定ALDH2蛋白表達

①提取心肌組織中的總蛋白：稱取大鼠心肌組織，將其剪成小塊;加入蛋白酶抑制劑液和蛋白裂解液2ml，充分研磨;用超聲將細胞裂解后離心10分鐘，離心后用取上清;加入Loading Buffer后煮樣5分鐘;BCA法測定蛋白濃度。②配制SDS-PAGE凝膠：配制前將兩塊玻璃板安裝完畢，將配好得分離膠試劑（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 8.8PH，SDS，過硫酸銨AP，TEMED）快速混勻，抓緊注入玻璃板間隙，直至玻璃板2/3高度，蒸餾水封膠，靜置半小時后，倒掉水;接著把濃縮膠混合液（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 6.8PH，SDS，過硫酸銨AP，TEMED）注入玻璃板間隙中直至小玻璃板位置;插入梳子，靜置1小時后上樣。③電泳：85v電壓下跑膠。④轉(zhuǎn)膜：撬開兩塊玻璃，去掉上層濃縮膠，只留分離膠，將分離膠放入轉(zhuǎn)膜液中;在轉(zhuǎn)膜夾上按順序放上海綿2層，濾紙3層，SDS-PAGE凝膠，NC膜，濾紙3層，將其移入含有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中;接通電源，350mA恒流跑90分鐘。⑤封閉：將NC膜取出放入封閉液中，搖床封閉1小時，封閉結束后在TBST液中清洗25分鐘。⑥孵育一抗：將NC膜按照所需的目的蛋白的分子量進行裁剪;剪好的條帶放入到用5%BSA稀釋過的一抗中，放入冰柜中低溫搖床過夜。⑦孵育二抗：取出抗體中的條帶，在TBST液中漂洗3遍，每遍15分鐘;接著放入稀釋后的二抗中，室溫下?lián)u床孵育2小時;孵育結束之后，重復上面步驟。⑧曝光：按照A：B=1：1提前配制好ECL發(fā)光劑，避光保存;將條帶放進超敏化學反應儀中，加上發(fā)光劑，進行曝光。

2.3統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，進行單因素方差分析;各指標間相關采用Person相關分析。統(tǒng)計分析用GraphPad Prism 5和SPSS 20.0軟件處理，P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 血清總膽固醇（TC）指標

與普食對照組相比，高脂對照組的TC值顯著升高（P<0.05），并且超過正常范圍的參考值;與飲食限制組相比，高脂對照組的TC值顯著升高（P<0.05）;飲食限制組的TC值較普食對照組有升高趨勢（P>0.05）。

3.2血清肌酸激酶（CK）活性測試

高脂對照組和飲食限制組的CK值較普食對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與飲食限制組相比，高脂對照組的CK值有升高的趨勢，但是差異不具有顯著性（P>0.05）。

3.3 Western blot檢測ALDH2的蛋白表達

高脂對照組ALDH2表達較普食對照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高脂對照組ALDH2表達較飲食限制組明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）;飲食限制組ALDH2表達較普食對照組有下降趨勢，但是差異沒有顯著性（P>0.05）。

3.4指標間相關分析

TC和CK指標之間具有相關性（P<0.05）;TC和ALDH2指標之間具有相關性（P<0.05）;CK和ALDH2指標之間具有相關性（P<0.05）。

4 討論與分析

4.1 高脂飲食對大鼠總膽固醇和肌酸激酶水平的影響

本實驗主要的研究目的是探討高脂飲食對肥胖大鼠心肌中ALDH2表達的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，高脂對照組的TC值顯著高于普食對照組，并且超過正常范圍的參考值，而飲食限制組后四周改用標準飼料后，TC值相較于高脂對照組來說顯著降低，證明八周的高脂飲食使得大鼠血清中TC水平升高，對大鼠進行飲食控制后體內(nèi)的TC水平下降。在大鼠CK的活性檢測中發(fā)現(xiàn)，高脂對照組和飲食限制組的CK值較普食對照組均顯著升高，而且高脂對照組的CK值較飲食限制組有升高趨勢。研究顯示在心肌損傷中，細胞會釋放多種酶，尤其是CK。雖然并不能完全通過CK值驗證是否造成了心肌的損傷，我們可以在一定程度上推測心肌受損的發(fā)生。通過TC值和CK活性的實驗測試，可以驗證高脂飲食使大鼠體內(nèi)的總膽固醇和肌酸激酶水平升高，長期進食高脂食物增加了心血管疾病的患病風險。

4.2 乙醛脫氫酶2（ALDH2）對心肌的保護作用

本實驗通過蛋白印跡免疫法檢測高脂大鼠ALDH2蛋白的表達，可以發(fā)現(xiàn)高脂對照組的ALDH2蛋白表達較普食對照組來說顯著降低;與高脂對照組相比，飲食限制組的ALDH2蛋白表達則有顯著提高，結果提示由高脂造成的心臟功能受損與ALDH2的表達下降有關，ALDH2表達增加有保護心肌，降低心血管疾病風險的作用。本實驗選擇ALDH2 作為高脂飲食對心肌影響的研究點，是因為ALDH2已經(jīng)成為當前研究和治療高脂血癥和相關心血管疾病的重要方向。

據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織的報告顯示缺血性心臟病是占據(jù)首位的死亡原因，而我國的心血管病發(fā)病人數(shù)在2018年達到2.9億。飲酒，高脂和高糖的飲食方式會刺激心血管，誘發(fā)病變的發(fā)生。乙醛脫氫酶2（ALDH2）是線粒體內(nèi)重要的醛類氧化酶，它參與了4-HNE的代謝過程。而4-HNE是醛類中主要的代謝產(chǎn)物，毒性很高，在心肌缺血損傷中，氧自由基增加，細胞內(nèi)的非飽和脂質(zhì)被氧化，釋放大量的有毒醛類物質(zhì)，大量毒醛類物質(zhì)的堆積，會對心肌細胞造成很強的毒性作用，因此以ALDH2參與4-HNE為切入點，揭開了它對于心肌的保護作用。酒精的大量攝入會使心功能降低，從而造成心肌損傷。山東大學的研究指出，乙醛脫氫酶2通過抑制p38MAPK/CREB通路的激活，從而抑制心肌中血管緊張素原和血管緊張素Ⅱ的升高，最終改善酒精引起的心肌損傷[6]。最近實驗表明ALDH2通過調(diào)節(jié)自噬水平，保護線粒體結構、功能密切來保護心肌[3]。有研究證實了在心功能衰竭的線粒體中ALDH2低表達，心功能衰竭后心肌梗死時間越長，ALDH2的水平就越低，提示ALDH2具有保護心臟的作用。還有實驗利用轉(zhuǎn)染法使ALDH2的基因高表達，結果顯示心肌梗死受損面積減少了47%。目前阿爾達（alda-1）被認為是ALDH2的激動劑，它能夠加快乙醛代謝，提高ALDH2的活性，增加ALDH2的表達，可以有效防止冠心病的發(fā)生，并且增加ALDH2的活性可以減少缺血再灌注后心肌梗死的面積[4]。有研究報道ALDH2rs671位點突變的人群具有更高的心血管事件的發(fā)生率，但是具體的分子機制尚不清楚。Shanshan Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2通過與低密度脂蛋白受體（LDLR）和AMPK相互作用，調(diào)控泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊的形成。實驗可知，雙敲出ALDH2/LDLR的小鼠比敲出LDLR的小鼠動脈粥樣硬化的斑塊明顯減少[5]。可見ALDH2的表達和活性與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。

4.3 展望與建議

隨著生活水平的提高，人們的飲食方式發(fā)生著變化，致使心血管疾病的發(fā)病率不斷升高。本文僅就高脂飲食一個致病因素作為研究，實驗結果顯示，飲食限制組大鼠的TC值較高脂對照組顯著下降，并且CK活性較高脂對照組也有下降的趨勢，證明限制高脂飲食可以降低心血管疾病的發(fā)病風險，因此飲食結構的調(diào)整尤為重要。人們應按照膳食結構合理的安排一日三餐，要多吃植物油，減少動物油的攝入。每天脂肪的攝入量在50克左右為宜，保證不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例>1.5。限制富含膽固醇多的食物，可以多吃洋蔥，大蒜，香菇之類的可以降低膽固醇的食物。以谷物為主;多吃新鮮的瓜果蔬菜，保證各類營養(yǎng)物質(zhì)的均衡攝取。清淡飲食，少鹽少油。限制飲酒量，研究顯示適量飲酒可以提高ALDH2的活性，保護心臟，過度的飲酒則會增加高血壓，心力衰竭，腦猝死的風險。同時，積極參加體育運動，已有研究證實，運動可以預防心血管疾病的發(fā)生并改善疾病程度。本研究通過總膽固醇和肌酸激酶兩個指標判斷心血管疾病的風險，仍需要結合病理形態(tài)學觀察。證實高脂飲食的攝入使得心肌乙醛脫氫酶2表達下降，但是具體的調(diào)控其蛋白表達的分子信號通路不清楚。

5 結論

八周高脂飲食可引起大鼠血清中總膽固醇和肌酸激酶的水平升高，心肌ALDH2蛋白表達下降，提示心血管疾病風險增加。盡早調(diào)整飲食結構，減少高脂食物的攝入，可以降低血清總膽固醇水平，增加心肌ALDH2蛋白表達，從而降低心血管疾病風險。

參考文獻

[1]陳偉偉，高潤霖，劉力生等.中國心血管病報告[J].中國循環(huán)雜志，2015，30（7）：617-622.

[2]李傳保，乙醛脫氫酶2對代謝綜合征小鼠心肌的保護作用及機制研究[D]山東大學博士論文，2015年.

[3]潘強強，高琴，王洪巨.乙醛脫氫酶2與心血管疾病研究進展[J].中國老年學雜志，2013年，33（8）：1962—1964.

[4]劉寶山.乙醛脫氫酶2（ALDH2）的心肌保護作用及調(diào)控機制研究.山東大學博士學位論文[D].2018年.