HPLCDAD法測定八味茵術顆粒劑中6,7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ的含量

陸麟 王卓君 戈大春 錢浩良

摘要目的：探討八味茵術顆粒劑中6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ的含量測定方法。方法：選取DIKMA Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，DAD檢測（200～400 nm）：6，7二甲氧基香豆素的檢測波長為340 nm，白術內酯Ⅲ的檢測波長為220 nm，白術內酯Ⅰ的檢測波長為275 nm。進樣量為5 μL，流動相為水（A）乙腈（B）梯度洗脫，流速為1 mL/min。結果：6，7二甲氧基香豆素在0.1～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好（R2=1.0000）、白術內酯Ⅲ在0.1～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好（R2=1.0000）、白術內酯Ⅰ在0.1～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好（R2=1.0000），其精密度、穩定性、加樣回收率均符合含量測定要求。結論：本方法簡單易行，準確可靠，可有效用于八味茵術顆粒劑的質量控制。

關鍵詞八味茵術顆粒劑;6，7二甲氧基香豆素;白術內酯Ⅲ;白術內酯Ⅰ;高效液相色譜;含量測定

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.012

八味茵術顆粒劑為我院的自擬協定處方，經過多年臨床使用，療效確切，由茵陳、生白術、茯苓、蒼術、黃芩、淡竹葉、澤瀉、梔子9味中藥組成。主要的功效是健脾利濕。臨床用于皮膚科濕瘡、濕疹，對于脾失健運的胃腸道癥狀，如胃納差、惡心腹脹、大便溏泄等也具有很好的效果。方中茵陳清利濕熱、利濕，白術健脾益氣、燥濕利尿，共為君藥，行健脾利濕之功，在我院皮膚科得到廣泛應用。為了更好的控制該制劑的質量，選用高效液相色譜法進行含量測定，選用方中君藥的有效成分6，7二甲氧基香豆素，白術內酯Ⅲ和白術內酯Ⅰ作為指標性成分。

1儀器與試藥

1.1儀器

Sartorius BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）;SHIMAZU LC2030C 3D高效液相色譜儀（日本SHIMAZU公司）;HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;DZF6050MBE型真空干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）;AC220240V超聲波清洗機（深圳深華泰超聲洗凈設備有限公司）。

1.2試劑

6，7二甲氧基香豆素（中國藥品生物制品檢定所，批號：111740200702）;白術內酯Ⅲ（中國藥品生物制品檢定所，批號：111978201501）;白術內酯Ⅰ（中國藥品生物制品檢定所，批號：111975201501）;乙腈[高效液相色譜法（HPLC），MERCK，德國];甲醇（HPLC，MERCK，美國）。

1.3分析樣品

八味茵術顆粒（自制，批號：171203、171225、180402）。本品為淺棕色或棕色顆粒狀，氣微，味苦。粒度、含水量、顆粒溶化性均符合《中華人民共和國藥典》2015年版的規定。

2方法與結果

2.1色譜條件

DIKMA Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，DAD檢測（200～400 nm），流速為1 mL/min，進樣量為5 μL，流動相為水（A）乙腈（B）梯度洗脫，0～10.0 min，55% MPB，10.0～25.0 min，55%～95%MPB，25.0～25.1 min，95%～55%MPB，25.1～30.0 min，55%MPB。理論板數按3種標準品6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ峰計算應不低于3 000。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

取6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3供試品溶液的制備

精密量取八味茵術顆粒20.0 g，置20 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，過濾，取續濾液5 mL，轉移至50 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，即得含量測定的樣品溶液。

2.4專屬性試驗精密吸取6，7二甲氧基香豆素、白術內酯III、白術內酯I對照品溶液，按2.2.2項下的色譜條件進行測定;精密量取八味茵術顆粒適量，按照2.2.1供試品溶液的制備項下制備樣品溶液，依照2.2.2項下的色譜條件進行測定，建立各樣品的特征圖譜，理論板數按3種標準品6，7二甲氧基香豆素、白術內酯III、白術內酯I峰計算應不低于3 000。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.5線性關系考察

精密稱取6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ對照品適量，分別配成濃度為0.1 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、10.0 μg/mL、30.0 μg/mL、100.0 μg/mL的溶液，分別精密吸取上述各對照品溶液5 μL，按2.1項下的色譜條件測定，以6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。見表1。其標準曲線見圖2～4。

2.6中間精密度試驗

取按照2.2和2.3項下制備八味茵術顆粒的樣品溶液，連續進樣5次，記錄峰面積A，計算6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ濃度的RSD值。測定結果表明6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ的進樣精密度良好。見表2。

2.7供試品溶液穩定性試驗

按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒的樣品溶液，進樣分析。于4、8、12、24 h后分別再次進樣分析，記錄并比較6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ含量的變化，評價樣品溶液中6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ室溫放置不同時間的穩定情況。測定結果表明6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ在室溫放置24 h之內穩定性良好。見表3。

2.8重復性試驗

按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒的樣品溶液，進樣分析。平行測定6份，記錄峰面積A，計算6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ濃度的RSD值。測定結果表明重復性良好。見表4。

2.9回收率試驗

取八味茵術顆粒2.0 g，精密稱定，置20 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液進行HPLC測定，得到樣品中6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ的含量A mg。

取八味茵術顆粒2.0 g和相應對照品B mg，精密稱定，置20 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇：水（1∶1），室溫超聲提取15 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液進行HPLC測定，得到樣品中6，7二甲氧基香豆素、白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ的含量C mg。平行3份。見表5。

2.10樣品測定結果

分別稱取制備的3批八味茵術顆粒，按照2.2和2.3項下操作，制備八味茵術顆粒樣品溶液，進樣分析。見表6。

3討論

八味茵術顆粒劑為基于中醫藥理論而成的純中藥制劑，由茵陳、生白術、茯苓、蒼術、黃芩、淡竹葉、澤瀉、梔子等8味中藥組成。白術和茵陳為方中君藥。白術對消化體統、免疫系統、泌尿系統有多種藥理作用[110]，比較明確的是白術有健脾益氣、調節胃腸運動的功能的特點，能夠使唾液淀粉酶活性增強、對腸管功能進行調節、對腸管吸收具有促進作用，有實驗證明白術內酯Ⅰ為健脾的有效成分[11]。茵陳利濕退黃，同樣具有多種的藥理作用[1217]，主要體現在保肝利膽、調節免疫、抗病原微生物等方面，其中6，7二甲氧基香豆素有利尿、降低膽固醇和三酰甘油之功效[1819];由于中藥復方成分復雜，干擾因素多，因此需要一個簡單可行的含量測定方法來監測八味茵術顆粒的質量，雖然有時中藥復方中有效成分往往不是含量最高的，有的甚至很難檢測到，為含量測定帶來難度，如白術內酯Ⅰ，預實驗選用RIGOL的HPLC基本檢測不到，但是白術的內酯類成分是活性成分，最后選用SHIMAZU LC2030C 3D的HPLC進行含量測定，以君藥茵陳、白術中的有效活性成分作為含量測定的指標性成分。

查閱有關白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素含量測定的文獻[2024]，并且結合預實驗的數據發現白術內酯Ⅲ在220 nm波長處有最大紫外吸收，白術內酯Ⅰ在220 nm波長處的紫外響應卻很低，但是在275 nm處有最大吸收;而6，7二甲氧基香豆素在275 nm波長處幾乎沒有紫外吸收，在340 nm波長處有最大紫外吸收，首先選擇了檢測波長切換的方法對其進行含量測定：0～5.0 min檢測波長為340 nm，5.01～12.0 min檢測波長為220 nm，12.01～30.0 min檢測波長為275 nm，但是最終得到的液相圖譜基線不穩定，于是最終確定HPLCDAD全波長掃描法對其進行含量測定。

預實驗同樣對提取溶劑和提取時間的選擇進行了考察。提取溶劑選擇了甲醇：水（1∶1）、甲醇和水3種，提取方式選擇超聲，分別考察了顆粒劑在15 min，30 min和45 min的3種有效成分的提取率，指標性成分對于提取溶劑的敏感度各不相同：6，7二甲氧基香豆素在純甲醇中幾乎沒有被提取，白術內酯Ⅲ在水中提取率最高，但白術內酯Ⅰ在水中提取率最低。指標性成分對于提取時間的敏感度也各不相同：白術內酯Ⅲ在水中提取率隨時間延長而增加，但是在甲醇中卻隨時間延長而降低;6，7二甲氧基香豆素不管在何種溶劑中其提取率均隨時間的延長而降低;白術內酯Ⅰ在水中提取率不隨時間變化，但在甲醇中提取率隨時間延長而增加，卻在甲醇：水（1∶1）中隨時間延長而降低。故綜合考慮，最終選擇甲醇：水（1∶1）作為提取溶劑，提取時間為15 min。

預實驗對含量測定的流動相和色譜柱進行了簡單的考察。流動相選擇了乙腈和不同濃度的磷酸水溶液（0.05%，0.1%，1.0%）梯度洗脫，基本無差異，故最后選擇比較簡單的乙腈水作為流動相。色譜柱首先選擇Phenomenx Luna C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），白術內酯Ⅲ和白術內酯Ⅰ能得到有效分離，峰形良好，但是6，7二甲氧基香豆素無論何種流動相，峰形都不理想，后來改為DIKMA Diamonsil C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，3種指標性成分的峰形和分離情況都良好，故色譜柱選擇DIKMA Diamonsil C18（2）。

通過對八味茵術顆粒的性狀、粒度、含水量、溶化性、含量測定等研究，建立了其質量標準的方法，通過控制方中活性成分的白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅰ和6，7二甲氧基香豆素的含量，為八味茵術顆粒的藥效指標及臨床療效的重復性和穩定性提供了保障，也為中試產品的質量標準建立奠定了方法學基礎。利用DAD檢測器建立多波長高效液相色譜法，可在同一色譜條件下利用不同檢測窗口實現多類組分、多個成分的同時定性、定量測定，提高了效率。該方法簡單易行，準確可靠，可有效用于八味茵術顆粒劑的質量控制。

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（2018-06-06收稿責任編輯：楊覺雄）