基于氣相色譜質譜的脂肪萎縮小鼠血漿代謝組學研究

吳琪 吳雅韻 韋世杰 余玉英

摘要目的：脂肪萎縮是引起糖脂代謝紊亂的重要因素之一。通過氣相色譜質譜聯用（GCMS）技術分析aP2nSREBP1c脂肪萎縮小鼠血漿代謝譜的變化，研究與其密切相關的差異代謝物與代謝通路，探討其生物學基礎。方法：應用GCMS技術對6只同窩野生型小鼠和6只轉基因小鼠血漿樣品進行檢測，對檢測結果進行多元統計分析，篩選出顯著差異的代謝物，借助MetaboAnalyst分析代謝通路。結果：與野生型（wildtype，WT）小鼠比較，轉基因（transgenic，TG）小鼠血漿中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。代謝通路富集分析發現3條脂肪萎縮相關通路。結論：通過對aP2nSREBP1c小鼠血漿代謝組學分析，發現纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝途徑與脂肪萎縮相關，為闡明糖脂代謝性疾病的發病機制提供了代謝組學依據。

關鍵詞脂肪萎縮;氣相色譜質譜聯用;代謝組學

中圖分類號：R917文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009

脂肪萎縮是一種異質性、遺傳性或獲得性疾病，主要特征是身體脂肪的選擇性喪失[1]。過量的脂肪累積或組織萎縮導致脂肪對脂質的儲存能力不足，引起外周組織脂毒性損傷和低度炎性反應，增加糖尿病和動脈粥樣硬化等糖脂代謝性疾病風險[2]。近年來國內外已有相關文獻應用代謝組學技術對肥胖癥進行研究，發現了許多與肥胖相關的代謝標志物[35]，但是在脂肪萎縮的代謝組學方面的研究是缺乏的。事實上，脂肪萎縮的遺傳突變表型在代謝綜合征中并不罕見;脂肪萎縮與肥胖可同時發生，其代謝后果相似可能疊加[67]。因此，研究脂肪萎縮下小分子代謝物的變化有利于更加全面認識糖脂代謝性疾病的發病機制，并在此基礎上研發防治策略和藥物。

近年來，代謝組學的快速發展為生命科學的研究提供許多便捷，它能定量檢測生物體在病理生理刺激或遺傳環境因素改變下所產生的動態變化，對于明晰機體發生的代謝變化指出方向。目前，多種分析技術應用于代謝組學研究，而GCMS的應用較為廣泛，其特點包括較高檢測靈敏度和可供參考的標準譜圖庫，能夠定性分析代謝產物[8]。aP2nSREBP1c轉基因小鼠具有白色脂肪少，棕色脂肪肥大的特點。隨年齡增加，肝臟脂肪異位沉積逐漸加重，并且伴有嚴重的胰島素抵抗問題[9]。由于糖脂代謝紊亂和脂肪生成分化障礙，該小鼠曾用作先天遺傳引起的脂肪萎縮癥或糖尿病研究[1011]。本實驗主要借助GCMS儀器對aP2nSREBP1c轉基因小鼠的血漿樣品進行代謝組學檢測與分析，旨在探究脂肪萎縮條件下血漿代謝物的變化，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物aP2nSREBP1c轉基因小鼠由美國Jackson實驗室引進，委托南京大學模式動物研究所凈化，動物合格證編號：J003393 SCXK（蘇）20100001。動物實驗期間均飼養于廣東藥科大學實驗動物中心。飼養繁殖條件：SPF級動物房，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h：12 h晝夜間斷照明，進食普通飼料，自由飲食飲水。

1.1.2試劑與儀器渦旋混合器（德國IKA公司）;臺式高速冷凍離心機（美國SCILOGEX公司）;DK8D電熱恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）;HGC24A型氮吹濃縮儀（天津市恒奧科技發展有限公司）;Agilent 7890B/5977B型氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent公司）。甲醇（色譜純，德國Merck公司）;甲氧胺鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F1601013）;吡啶（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;N，O雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷）（87VMHMM，東京化成工業株式會社）;正庚烷（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）;超純水。

1.2方法

1.2.1動物分組aP2nSREBP1c轉基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的雜合子個體，參照Jackson實驗室基因型鑒定方法鑒定轉基因型和野生型，根據基因型把小鼠分為WT組和TG組。

1.2.2檢測指標與方法

1）脂肪組織形態觀察：經乙醚麻醉側眼底靜脈叢取血后處死小鼠，迅速分離脂肪組織，置于4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，HE染色，進行病理形態觀察分析。

2）血漿樣品獲取與前處理：10周齡小鼠12 h禁食后經乙醚麻醉，側眼底靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，離心（3 000 r/min，4 ℃，15 min）取血漿。吸取50 μL新鮮血漿于離心管中，加入200 μL甲醇沉淀蛋白質，渦旋混勻1 min，離心10 min（15 000 r/min，4 ℃），取上清液200 μL氮氣吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混勻，在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA（含1%TMCS），在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷，渦旋混勻后離心移取上清至微量進樣管，待GCMS分析。

3）測定條件：色譜柱：HP5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）;進樣量：1 μL;進樣口溫度：260 ℃;進樣模式：不分流進樣。升溫程序：起始溫度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。電離方式：EI;電子轟擊能量：70eV;離子源溫度：230 ℃;四級桿溫度：150 ℃;溶劑延遲：11 min。

4）數據處理及差異代謝物篩選：使用GCMS聯用儀對血漿樣品進行檢測分析，經過積分后利用美國國家標準與技術局化學數據庫（NIST）進行化合物比對。將比對后的數據導入MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）在線分析網站，采用無監督模式識別的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）觀察各組分分離趨勢，根據倍數變化>1.5和P<0.05篩選差異代謝物[12]，以匹配分數大于80的鑒定結果作為可信結果。

1.3統計學方法采用SPSS軟件對樣本進行統計分析，2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。采用MetaboAnalyst進行代謝通路富集分析，鑒別出2組間差異顯著的代謝通路。

2結果

2.1表型評價白色脂肪病理切片觀察HE染色中，細胞質的脂肪被溶解呈空泡狀，細胞核位于細胞一側。與野生型（WT）小鼠比較aP2nSREBP1c轉基因（TG）小鼠白色脂肪細胞內脂滴較少且體積較小。TG小鼠白色脂肪呈萎縮狀態。見圖1。

2.2血漿非靶向代謝組學TIC圖采用GCMS技術對小鼠血漿進行分析，得到血漿代謝物的總離子流圖，從中得到樣品的化合物信息，質譜信息，離子豐度等。結果顯示2組樣本多數代謝物的出峰時間集中在12～37 min，但在峰信號和峰數目上存在差別，TG組的峰信號明顯強于WT組，表明2組的血漿代謝輪廓存在一定差異。見圖2。

2.3主成分分析（PCA）PCA分析是一種無監督模式識別的多元變量統計分析方法，可以通過降維的方式，反映出高維數據樣本之間的差異。結果如圖3所示，PCA得分圖上WT與TG樣本點分散于不同區域，說明正常WT小鼠與TG小鼠血漿內源性代謝物具有差異。

2.4差異代謝物的篩選結果本研究共篩選出11種差異代謝產物，與WT比較，TG組中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。見表1、圖4。

2.5代謝產物通路分析將11種差異代謝物導入MetaboAnalyst進行在線數據處理分析。圖中每個圓圈對應相關的通路，圓圈的著色代表代謝物在數據中具有不同程度的顯著性，著色越深，差異越大;反之，差異越小。根據通路影響值（pathway impact>0.1）得到：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝，共3條與脂肪萎縮相關的代謝通路。見圖5。

3討論

實驗以aP2nSREBP1c轉基因小鼠作為研究對象，應用GCMS技術對血漿樣本進行代謝組學研究，共篩選出11個差異代謝物（包括氨基酸、脂肪酸、糖）。這些代謝物在脂肪萎縮小鼠血漿中顯著上調，表明小鼠體內發生了代謝紊亂。通路富集表明差異代謝物在體內主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，丙酮酸代謝，磷酸肌醇代謝途徑。

纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成屬于支鏈氨基酸（Branched Chain Amino Acids，BCAA）的生物合成途徑。BCAA是一種特殊的必需氨基酸。研究認為，BCAA能夠激活雷帕霉素（the Mammalian Target of Rapamycinm，mTOR）靶點引起胰島素抵抗[1314]。機體中BCAA缺乏時，白色脂肪內硬脂酰輔酶a、脂肪酸合酶均被抑制，棕色脂肪組織內解耦聯蛋白1表達水平增加，產熱耗能增強，脂肪含量快速減少，機體呈現消耗表型[1516]。此外，BCAA被證明可以通過mTOR信號在下丘腦的水平上調節脂肪的瘦素分泌和食物攝入[17]。本研究中纈氨酸在轉基因小鼠中的血漿代謝水平顯著升高，這可能與小鼠脂肪因子信號通路受損相關[18]。

肌醇參與了磷酸肌醇的代謝途徑。肌醇是許多二級信使的前體分子，由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的組成部分。在胰島素發揮作用的過程中，磷脂酰肌醇是重要的遞質，參與多種信號的傳遞。乳酸參與丙酮酸代謝途徑。丙酮酸作為物質代謝的重要中間體，可通過三羧酸循環實現體內糖、脂肪和氨基酸的相互轉化，是三大營養物質代謝聯系的樞紐。與酮體代謝相關的3羥基丁酸，與脂肪酸代謝相關的硬脂酸、油酸、棕櫚酸、11十八碳烯酸，與糖代謝相關的d半乳糖、D阿洛糖、與蛋白質代謝相關的尿素，血漿代謝水平升高。提示脂肪萎縮可能導致機體的糖脂代謝紊亂，能量代謝異常問題。

脂肪組織不僅是能量儲備器官，它還是一個具有多種內分泌、自分泌和旁分泌功能的內分泌器官，脂肪組織通過分泌多種激素及信號調節分子，與胰腺、肝臟、中樞神經系統、免疫系統等進行器官對話[19]。過量的脂肪累積或組織萎縮都將影響全身的代謝。本研究使用的代謝組學技術有助于系統了解機體總的病理生理過程，契合中醫學“整體觀念，辨證論治”理論。通過該技術分析脂肪萎縮小鼠的差異代謝物變化及其代謝途徑，能一定程度上反映脂肪萎縮小鼠代謝水平變化，將為闡明糖脂代謝性疾病的發病機制，研發該病中醫藥/中西醫結合防治策略和創新藥物，提供代謝組學的實驗依據。

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（2018-12-10收稿責任編輯：王楊）