動物模型移植人源腸道菌群在中醫藥防治糖脂代謝病中的關鍵技術和挑戰

吳佳銘 高翔 謝抗 榮向路 葉得偉

摘要糖脂代謝病是影響和危害全球公共健康的一類重大疾病。近年來，越來越多的證據指向糖脂代謝病和腸道菌群結構和功能改變密切相關。但是，臨床研究很難在人群進行干預試驗揭示腸道菌群改變與疾病核心機理的因果關系。因此，動物模型移植人源腸道菌群成為揭示中醫藥等干預策略或臨床特征與腸道菌群改變因果關系的關鍵研究策略之一。動物模型移植人源腸道菌群研究方法主要包括4個主要步驟：1）采集觀察組和對照人群的的糞便，進行移植菌液制備;2）廣譜抗生素誘導的條件性無菌小鼠誘導;3）運用整體菌群或經宏基因組學分析鑒定出的特異性菌屬，移植到條件性無菌小鼠后，進行代謝性疾病動物模型誘導;4）比較分別接受干預組和對照組人源腸道菌群移植小鼠的糖脂代謝表型。作為腸道菌群研究領域的前沿方法之一，動物模型移植人源腸道菌群為中醫藥防治糖脂代謝病提供了新思路和線索。

關鍵詞糞便菌群移植;糖脂代謝病;腸道菌群;中醫藥藥效學;無菌小鼠

中圖分類號：R2031;R825.8文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.007

人類腸道中含有數萬億的細菌，統稱為腸道菌群。腸道中的微生物被認為是宿主生理中起關鍵作用的重要器官。人類腸道中微生物群的多樣性和物種的豐富性在出生2到4年后迅速增加，成年后則保持相對穩定[1]。一個穩定的腸道群落可以抵抗病原菌的定植，當腸道菌群受到干擾時，細菌多樣性減少以及耐定植性降低，可使數量較少的致病菌增多并引起疾病，例如使用抗生素后艱難梭菌的感染（CDI）。

糖脂代謝病是影響和危害全球公共健康的一類重大疾病。近年來，越來越多的證據指向糖脂代謝病和腸道菌群結構和功能改變密切相關。但是，臨床研究很難在人群進行干預試驗揭示腸道菌群改變與疾病核心機理的因果關系。因此，動物模型移植人源腸道菌群成為揭示中醫藥等干預策略或臨床特征與腸道菌群改變因果關系的關鍵研究策略之一。

1腸道菌群移植（FMT）的發展歷史

為了恢復腸道菌群的平衡，醫生將健康人群糞便中的功能菌群轉移到患者的腸道內，即糞便菌群移植技術（Fecal Microbiota Transplantation，FMT），也被稱為糞便細菌療法、糞便輸液、糞便移植或糞便灌腸等。FMT在治療多種疾病方面有著悠久的歷史。公元300～400年間，東晉時期醫家葛洪在《肘后備急方》中記載運用FMT治療食物中毒、發熱、腹瀉并瀕臨死亡的患者，述“絞糞汁，飲數合至一二升，謂之黃龍湯，陳久者佳”，還記載了“驢矢，絞取汁五六合，及熱頓服，立定”，可見有奇效[2]。《肘后備急方》是中國第一本急癥醫學書籍，也是世界上最早記錄青蒿治療瘧疾的文獻。采用人的糞便進行多種消化道急危重癥的治療，在明朝更是幾乎達到極致。16世紀，李時珍所著的《本草綱目》記載用人糞治病的療方多達20種，記載了將各種糞便衍生產品，用于胃腸道和全身癥狀疾病，如嚴重腹瀉、發熱、嘔吐和便秘等[2]。中醫學一直是現代醫學的寶庫，中國古代用糞便治病的方法，看似離譜，但在今天終于找到了對應的科學解釋。盡管中醫對FMT治療疾病的應用歷史悠久，但是FMT與病證關系的機理需要更深入的探究。

2FMT的應用現狀

近年來，越來越多的研究發現腸道菌群與多種疾病相關，例如：梭狀芽胞桿菌感染（CDI）、炎癥性腸病（IBD）和代謝性疾病（如肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎）等。目前，已經證明FMT在CDI治療中的效果優于抗生素[3]。此外，FMT在治療多種代謝性疾病中也具有巨大的潛力。

2.1FMT和肥胖

無菌（Germfree）小鼠的出現和測序方法的技術進步，促使微生物在體重管理和葡萄糖、脂質代謝的因果關系研究中取得重大進展。Backhed等人[4]將肥胖和糖尿病模型小鼠的糞便移植到Germfree健康小鼠后，發現即使減少了進食量，Germfree（C56BL/6J）小鼠的體重和胰島素抵抗仍然成升高趨勢。另外，將ob/ob肥胖小鼠的菌群移植到Germfree小鼠后，發現普通飼料喂養的Germfree小鼠也會出現肥胖表型[5]。2013年，Ridaura等人[6]首次將人類糞便移植到Germfree的C57BL/6J小鼠體內，發現移植了肥胖人群糞便材料后的小鼠體重出現升高。

2.2FMT和糖尿病

到目前為止，只有一個隨機對照臨床試驗研究了FMT對胰島素抵抗的影響[7]。研究人員發現9例胰島素抵抗的糖尿病患者經過6周的FMT治療，腸道微生物多樣性增加、短鏈脂肪酸含量增加并且胰島素敏感性改善。雖然FMT對胰島素敏感性的影響是顯著的，但因為它是一個侵入性的過程，所以不太可能應用于未來的治療。此外，受試者即使有大量腸道菌群是由移植而來，但腸道菌群的組成分析結果證明受試者的腸道菌群還可以恢復到最初狀態[8]。雖然目前只有一個RCT試驗，但是FMT對未來糖尿病的治療仍然提供了新的思路和線索[9]。

2.3FMT和非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪肝炎

非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）和非酒精性脂肪肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）易發生在過量脂肪堆積在肝臟時，其中大部分患者都伴隨有肥胖和胰島素抵抗。全球的肥胖癥流行引發了NAFLD和NASH危機，但是缺乏有效的治療策略[10]。有研究發現同樣采用高脂飲食誘導NAFLD小鼠模型和未成模小鼠，將模型小鼠的腸道菌群移植到Germfree小鼠體內，可以對Germfree小鼠產生類似HFD的影響，這提示腸道菌群可能在NAFLD的發病機制中發揮重要作用[11]。有研究結果表明NAFLD/NASH與腸道微生物群的改變，包括腸道通透性增加，乙醇產量改變，膽堿代謝障礙，以及膽汁酸信號障礙等相關[12]。

2.4FMT治療有關的臨床試驗

最近，Clinical Trials.gov公布了幾項正在進行的用于代謝性疾病治療的FMT臨床測試試驗。1）馬薩諸塞州綜合醫院招募健康的偏瘦人群作為供體，將其糞便以膠囊的給藥方式對肥胖人群進行FMT，以研究對體重和胰島素敏感性的影響（Clinical Trials.gov ID NCT02530385）。2）來自中國南京醫科大學的研究人員正在評估一項處于第3階段試驗的結果，旨在通過糞便菌群移植重建2型糖尿病患者的腸道菌群的功能（Clinical Trials.gov ID NCT01790711）。3）加拿大一項隨機對照試驗研究將來自健康志愿者的糞便細菌移植到患有代謝綜合征和NAFLD的患者中，以驗證FMT是否可以改變胰島素抗性并減少肝內脂肪堆積（Clinical Trials.gov ID NCT02496390）。這些臨床試驗表明FMT已經成為治療代謝性疾病的重點和熱點技術之一。

3動物模型移植人源腸道菌群的應用

3.1研究策略

在臨床試驗中，研究微生物群在各種疾病狀態下的作用機制是非常困難的，所以多以小鼠為主要研究對象建立人類微生物相關（HMA）動物模型，用于研究人類不同疾病狀態和微生物宿主之間的關系[13]。目前，解析與疾病表型相關的腸道菌群改變與疾病核心病理機制因果關系的關鍵研究策略，分整體菌群移植和經宏基因組學分析鑒定出的特異性菌屬（Strain）移植2種方式。第1種方式直接將糞便樣品制備成菌液或膠囊，然后通過灌胃或灌腸的給藥方式，將供體的整體菌群移植到Germfree小鼠體內。第2種方式是將人源糞便樣品進行宏基因組學測序，鑒定出疾病或證候相關的特異性菌屬，然后將純化的特異性菌屬通過灌胃的給藥方式注入Germfree小鼠體內，最后通過表型鑒定建立腸道菌群和疾病證候的因果關系。

3.2相關實驗設計

依據上述2種研究策略，FMT是揭示與特定藥物藥效學與腸道菌群改變相關性因果關聯的必需實驗設計。見圖1。首先，通過臨床招募志愿者的方式收集糞便樣品并制備，然后采用宏基因組測序的方式鑒定出與疾病或證候相關的特異性菌屬。在測序的同時，對入組人群依據證候或疾病診斷標準進行分組，并收集相關基本信息、生化指標和檢查結果。對樣品進行菌液或膠囊制備后，挑選不同背景的SPF級小鼠，進行無菌化處理后得到Germfree小鼠，隨后建立疾病或中醫證候模型。根據測序結果對Germfree模型小鼠經口給予菌液或特異性菌屬，監測Germfree小鼠不同組別的代謝表型。最后整合臨床信息、FMT動物表型及宏基因組測序結果，進一步闡釋腸道菌群與代謝性疾病的因果關系。

3.3關鍵技術

3.3.1糞便樣品供體的篩選FMT的研究之所以具有挑戰性，部分原因在于糞便的生物學復雜性[14]以及它在人與人之間的廣泛差異[15]。為了更好地完成FMT，我們提出了3項建議：1）研究人員應該利用適應性試驗來克服供體糞便異質性的挑戰，尋找差異性最大的糞便，盡可能的給觀察組提供最佳治療。2）盡可能齊全的收集供體人群的臨床信息，使研究人員能夠更好地評估糞便的異質性。例如，供體的年齡、性別、種族、飲食、病史等信息。3）研究人員應當盡量使用當地或全國的糞便樣品庫，標準化的供體篩選、糞便收集和處理流程有助于提高研究結果的可比性和可重復性。

3.3.2菌液的處理傳統的FMT療法使用的是經過醫學篩選的健康個體的新鮮糞便，但新鮮的糞便不會增加療效，還有感染受體的風險。另外，有研究表明新鮮、冷凍或凍干的FMT產品在治療反復發作的CDI時療效是相當的[1618]。因此，使用冷凍和凍干產品不僅可以儲存樣本，還能增加使用的靈活性。Nathaniel D等人[19]發現，相對于循環凍融和供體排便與移植制劑之間的延遲時間影響，氧氣暴露對糞便細菌群落減少的風險來說會更高。因此，我們建議最好是在厭氧艙中進行樣品處理，以保護厭氧細菌。新鮮糞便通常應在排便后6 h內處理完[20]，在糞便未處理之前盡可能保存在無氧環境中，新鮮糞便保存在4 ℃下8 h就會減少微生物10%的多樣性[21]。

糞便樣品處理過程分為混懸、離心、過濾。在臨床應用中多使用無菌鹽水（0.9%）來稀釋糞便材料，溶劑體積為3～5倍[2223]。然后，使用手工或專用攪拌機進行均質化，過濾和離心處理，以去除較大的顆粒，如未消化的食物。懸浮液倒入無菌容器中，密封保存，以待使用。此外，甘油可保護微生物細胞免受凍害，因此當制備冷凍樣品時，冷凍前應加入甘油至終濃度為10%，也有研究使用乙醇，但對乙醇的使用仍有爭議。有研究報道乙醇除了能殺死病原體外，還能嚴重改變共生菌群的組成，可能會消除噬菌體、真菌和非孢子細菌等關鍵元素[24]。最后，冷凍混懸液建議存儲在-80 ℃環境中[18]。

此外我們還可以使用自動機械化處理，比如南京醫科大學附屬第二醫院采用基于GenFMTer的凈化系統作為處理糞便[2526]的自動方法，實驗室流程的標準化可以縮短處理時間，并避免技術人員接觸糞便物質。基于冷凍糞便的FMT方法對于糞便庫的開發是必不可少的，并且是FMT過程標準化并允許按需獲得糞便的最佳方式。統一、標準化的糞便處理過程，對腸道菌群研究和FMT的使用至關重要，可以提高FMT的治療效果和實驗的可重復性。

3.3.3FMT的過程及小鼠管理在小鼠實驗中，對小鼠進行FMT都采用灌胃的方式，然而每個研究灌胃的周期和頻率并不相同，需根據具體實驗進行確認。微生物群的組成、多樣性和代謝活動受到多種環境因素的嚴重影響，包括飲食、水、光照、溫度、濕度、鋪墊材料、籠養條件、籠具更換頻率等，應將這些實驗參數進行詳細的記錄并且應當嚴格控制這些環境因素，以確保所有實驗小鼠在實驗前和實驗期間都處于相同的條件下。

3.4移植成功的標準及評價

FMT被認為是確認和證明腸道微生物研究中因果關系的黃金標準[2731]。然而，這些人源化模型中的宿主和微生物關系不一定可以反映人類中的真實關系，因為腸道菌群被移植到不同物種的宿主中。FMT是否移植成功，尚無明確的評價標準和體系。總的來說，目前的評價標準是：通過對FMT后小鼠和人源供體的腸道菌群進行基因測序分析，查看菌屬的豐度和物種是否具有相似性，鑒定FMT受體小鼠是否出現了與人源供體相似的特異性表型。為使FMT能更廣泛地應用于中醫藥防治糖脂代謝病，可能需要一個更加精準且合理的評價標準。

3.5FMT后代謝表型數據解釋中的常見問題

3.5.1移植后未出現表型轉移很多研究人員發現FMT實驗在移植后未出現表型。例如，Kristine H.Allin等人[32]在實驗中發現無法將糖尿病前期表型通過FMT轉移給小鼠，這可能有多種解釋。1）有些疾病的腸道微生物群的改變太過微妙，例如肥胖手術和二甲雙胍引起的改變[3334];2）關鍵菌群的移植程度可能太弱[23，35];3）由于小鼠和人類飲食差異、免疫應答的宿主特異性和本地微生物群的競爭等方面存在著相當大的差異，導致表型相關的特異性菌群無法定植[36]。

3.5.2影響FMT代謝表型因素較多FMT的結果容易被各種因素影響和干擾。1）環境因素。小鼠腸道基因圖譜顯示環境因素對腸道菌群的影響比小鼠品系、飼料或性別更為明顯。[37]此外，小鼠的糞食性會使同籠小鼠腸道菌群出現逐漸均勻化[3839]。來自母體陰道、糞便和皮膚微生物群的微生物也會影響后代腸道菌群的組成[40]。2）飲食因素。MARIE等人通過飲食管理改變小鼠或人體內的腸道菌群，進而改變代謝表型[13]，這說明飲食是決定腸道菌群組成的重要因素。Chenhong Zhang等人[41]發現，腸道菌群的組成與宿主的長期飲食模式和健康表型密切相關，這提示我們在評價腸道菌群組成時需要控制飲食變化。3）抗生素的影響。抗生素誘導Germfree小鼠時，會導致Germfree小鼠出現耐藥菌的感染，如艱難梭菌[4243]，還會導致免疫力持久下降等不良后果[4445]。一些研究表明，廣譜抗生素預處理不能促進外源微生物群的建立，甚至可能對外源的微生物群落產生有害影響[46]。研究報道采用包括兩性霉素B、萬古霉素，新霉素，甲硝唑，氨芐西林[47]在內的更廣泛的抗生素方案可明顯改善移植效果。

4FMT在中醫藥研究中的應用現狀及展望

口服屬于中藥經典的給藥方式之一，需要通過消化道對人體產生作用。現代研究發現不少中藥單藥和復方通過調節腸道菌群對一些疾病產生療效。在中藥單藥與腸道菌群的研究中，有研究報道黃連素灌胃可以顯著抑制非酒精性脂肪肝炎Babl/c模型小鼠中的乳酸菌和雙歧桿菌，并且可以改善肝內脂肪性炎性反應[48]。鄧志梅等人應用黃連素聯合二甲雙胍對比單純胰島素治療100例2型糖尿病患者時，發現聯合用藥組的雙歧桿菌、擬桿菌和乳桿菌水平出現顯著降低[49]。在復方應用方面，有研究人員針對450名患有2型糖尿病和高脂血癥的患者，采用專門設計的緩解高脂血癥和2型糖尿病的復方（AMC）作為觀察組并以二甲雙胍作為對照組進行治療，結果顯示AMC和二甲雙胍均顯著改變了腸道菌群結構并且改善了高血糖和高脂血癥的指標，但是AMC改善胰島素抵抗（HOMAIR）和血漿三酰甘油的程度較對照組而言更為明顯[50]。另外，有研究結果顯示四君子湯、理中湯和補中益氣湯灌胃可以調節脾氣虛證大鼠模型的腸道菌群，并且改善脾氣虛的癥狀[51]。盡管很多研究發現中醫藥單體和復方改善癥狀與調節腸道菌群之間的相關性，但是對中藥通過腸道菌群影響臟腑和治療疾病的功能性研究仍然需要進一步的探索和闡釋。

5討論

FMT在臨床應用上歷史悠久。近年來，研究者通過動物模型移植人源腸道菌群發現腸道菌群與多種疾病具有緊密聯系。運用FMT不僅可以幫助確認糖脂代謝病的表型與腸道菌群的因果關系，還能用于糖脂代謝病的治療。此外，通過FMT還可以挖掘中醫藥治療糖脂代謝病的新機制和新靶點，為研制新型藥物提供新的線索和思路。因此，動物模型移植人源腸道菌群對于系統、深入揭示中醫藥防治糖脂代謝病的療效和分子機制具有重要科學意義。

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（2018-12-10收稿責任編輯：徐穎）