大孔吸附樹脂純化山楂葉黃酮工藝研究

周志強(qiáng)　馬嬌豪

摘要：對(duì)4種大孔吸附樹脂純化山楂葉黃酮效果比較分析，結(jié)果顯示，D101型大孔吸附樹脂對(duì)山楂葉黃酮溶液吸附和解吸附效果較好。對(duì)山楂葉黃酮純化工藝進(jìn)行研究，確定了最優(yōu)的純化工藝條件為：采用上柱流速為2BV/h，樣液pH值為4.0為上柱吸附條件，洗脫液為70%的乙醇溶液，洗脫液用量為4BV，解析液流速為2BV/h解吸附最優(yōu)條件。采用D101型大孔吸附樹脂純化后，產(chǎn)品純度可達(dá)94.62%，可用于保健品的分離純化。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹脂;山楂葉黃酮;純化工藝

山楂葉含有豐富的氨基酸、微量元素及豐富的維生素，山楂葉中的黃酮類物質(zhì)具有一定的清除自由基功能，對(duì)心血管系統(tǒng)有一定的藥理作用。大孔吸附樹脂是近幾年發(fā)展起來(lái)的一類有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，具有價(jià)廉、反復(fù)利用、吸附容量大等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類黃酮物質(zhì)的分離純化，如，山楂黃酮、葛根黃酮、陳皮黃酮、枸杞黃酮、櫻桃葉黃酮的分離純化。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600型大孔吸附樹脂進(jìn)行篩選，并對(duì)大孔吸附樹脂分離純化山楂葉總黃酮的吸附率和解吸率進(jìn)行研究，為山楂葉黃酮化合物提取提供適宜的分離純化條件。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

山楂葉：太行山上山楂樹落葉前的綠葉;HP-20型大孔吸附樹脂購(gòu)置于日本三菱公司，非極性D-101型大孔吸附樹脂購(gòu)置于天津市海光化工有限公司，HPD-200型大孔吸附樹脂、HPD-500型大孔吸附樹脂、HPD-600型大孔吸附樹脂均由河北滄州寶恩化工有限公司提供。

主要試劑有：蒸餾水（pH7.0～8.0）、NaOH（分析純）、NaNO（分析純）、硝酸鋁Al（NO），（分析純）、95%乙醇（分析純）。

（二）儀器和設(shè)備

主要食品設(shè)備：

冷凍干燥機(jī)（上海翡諾醫(yī)藥設(shè)備有限公司）、真空干燥箱（上海皓莊儀器有限公司）、玻璃樹脂柱（3cm×50cm）和7200型分光光度計(jì)（上海尼龍柯儀器有限公司）、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司）、BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

（三）大孔吸附樹脂的預(yù)處理

用蒸餾水洗去破碎樹脂粒，濕法裝柱，將大孔吸附樹脂用適量95%乙醇浸泡24h，然后除去上清液，繼續(xù)用3BV95%乙醇沖洗至洗出液不渾濁，再用蒸餾水洗至洗出液無(wú)醇味;再用3BV的5%稀鹽酸以2mL/dmin流速?zèng)_洗樹脂，浸泡1h后再用蒸餾水以2mL/min流速?zèng)_洗至中性;最后用3BV20g/L的氫氧化鈉溶液以相同的流速?zèng)_洗樹脂，浸泡1h后用蒸餾水沖洗樹脂層至流出液pH值為中性。

（四）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取20.8mg蘆丁，用60%的乙醇溶解并稀釋至100mL，作為對(duì)照品溶液。精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%NaNO溶液1mL，使混勻放置6min，然后用1mL移液管移取10%的Al（NO）溶液1mL，使混勻放置6min，然后用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻放置15min，并做空白對(duì)照。按分光光度法在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，所取標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸收度數(shù)據(jù)經(jīng)回歸分析，得回歸方程為：y=11.687265x-0.008186，R=0.999719，結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.0083～0.04992mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（五）樣品溶液制備

樣品溶液取自曹樂(lè)民（參考文獻(xiàn)7）等人通過(guò)傳統(tǒng)工藝提取的山楂葉黃酮浸提液。

（六）山楂葉黃酮提取液分離純化工藝

山楂葉提取液→濾液上柱吸附→解吸→濃縮→干燥→山楂葉黃酮產(chǎn)品。

（七）山楂葉黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定

用1mL移液管取靜置冷卻后的濾液1mL至250mL容量瓶中，再用5mL移液管移取5mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法，在500nm波長(zhǎng)下，測(cè)定溶液吸光度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液黃酮濃度。

（八）大孔吸附樹脂吸附率和解吸率的測(cè)定

1、大孔吸附樹脂吸附容量和吸附率測(cè)定。準(zhǔn)確稱取處理好的濕樹脂2.0g，吸干后裝入100mL帶塞磨口錐形瓶中，加入山楂葉黃酮水溶液樣液50.00mL（V0），濃度為1.438mg/mL（C），置于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附24h后過(guò)濾，測(cè)定濾液中黃酮類物質(zhì)的濃度，計(jì)算大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率，計(jì)算公式如下：

3、大孔吸附樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)特征。稱取預(yù)處理過(guò)的大孔吸附樹脂2.0g（濕重）于帶塞錐形瓶中，精密量取50.00mL黃酮溶液，置于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附，在12h內(nèi)，每次取1.00mL。以大孔吸附樹脂與樣液接觸時(shí)開始計(jì)時(shí)，然后按下列時(shí)間10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h，以大孔吸附樹脂的黃酮靜態(tài)吸附量（E）對(duì)時(shí)間（t）作圖，繪制大孔吸附樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

二、結(jié)果與討論

（一）大孔吸附樹脂的篩選

1、不同大孔吸附樹脂對(duì)山楂葉黃酮溶液的吸附效果。稱取4種經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔吸附樹脂各2.0g于100mL磨口帶塞錐形瓶中，分別加入50.00mL山楂葉黃酮水溶液，于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附24h后抽濾，測(cè)定濾液中黃酮溶液的吸光度，計(jì)算靜態(tài)吸附容量和吸附率，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，D101型和HPD-200型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率明顯較高。因此，可以初步確定選用D101型和HPD-200型大孔吸附樹脂作為實(shí)驗(yàn)用樹脂。

2、不同大孔吸附樹脂對(duì)山楂葉總黃酮的解吸附效果。用蒸餾水洗滌樹脂至無(wú)色不渾濁，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液解吸附，置于搖床上以同樣的方法處理后取出，真空抽濾，測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算解吸附率，結(jié)果見表2。從表2的解吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D101型大孔吸附樹脂較HPD-200型大孔吸附樹脂的解吸附率高，因此，選用D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附和解吸附最合適。

3、大孔吸附樹脂動(dòng)力學(xué)吸附曲線。4種大孔吸附樹脂的動(dòng)力學(xué)吸附曲線如圖1所示。

從圖1中可以看出，4種大孔吸附樹脂對(duì)樣液的吸附均屬于快速平衡型，3h即達(dá)到平衡。不同類型大孔吸附樹脂對(duì)樣液中山楂葉總黃酮的吸附速率差異明顯，在4種大孔吸附樹脂中，D101型大孔吸附樹脂吸附容量最大，吸附速率最快。

（二）吸附條件對(duì)大孔吸附樹脂吸附效果的影響

1、上柱流速對(duì)樹脂吸附效果的影響。取濃度為1.0mg/mL、pH為4.0的山楂葉黃酮水溶液，分別于1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速上柱吸附，結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，上柱流速越小，大孔吸附樹脂的吸附量和吸附率越大。但上柱速率越小，耗費(fèi)時(shí)間就越長(zhǎng)，生產(chǎn)成本越高。綜合考慮，上柱流速為2BV/h較合適。

2、樣液濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響。流速為2BV/h、pH為4.0時(shí)，分別以不同濃度的樣液濃度上柱吸附，考察樣液濃度對(duì)吸附效果的影響，結(jié)果見表4。

從表4中可以看出，隨著樣液濃度的增加，樹脂的吸附容量和吸附率不是呈線性增加，當(dāng)樣液濃度超過(guò)2.0mg/mL時(shí)，吸附量和吸附率均下降，說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)超過(guò)D101大孔吸附樹脂的最大動(dòng)態(tài)吸附容量，吸附柱開始出現(xiàn)泄漏，因此，樣液濃度為2.0m/mL最合適。

3、樣液pH值對(duì)樹脂吸附效果的影響。樣液濃度為2.0mg/mL、上柱流速為2BV/h時(shí)，分別以不同pH值的樣液上柱吸附，考察吸附效果，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，在酸性條件下，D101大孔吸附樹脂對(duì)樣液中黃酮類物質(zhì)的吸附容量和吸附率沒(méi)有明顯差別，但隨著pH值的增大，樹脂的吸附容量和吸附率先增加，增加到一定時(shí)間后又降低，以pH值為4.0時(shí)，樹脂的吸附量和吸附率最高，因此，吸附液pH以4.0為最佳。

（三）解吸附條件對(duì)解吸效果的影響

1、解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響。對(duì)靜態(tài)吸附飽和的D101大孔吸附樹脂，采用不同濃度的乙醇溶液對(duì)大孔吸附樹脂解吸附，考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)解吸附效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，山楂葉黃酮的解吸率不斷增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，大孔吸附樹脂的解吸率趨于穩(wěn)定，考慮到環(huán)境污染、價(jià)格成本等因素，選用70%的乙醇溶液作為D101大孔吸附樹脂的解吸液最為合理。

2、解吸液用量對(duì)解吸效果的影響。稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂，加入適量的樣液，振搖使樹脂吸附至飽和，用蒸餾水洗至無(wú)色;濕法裝柱，然后用70%的乙醇溶液洗脫，流速控制在3BV/h，收集洗脫液，每0.5BV（10min）收集一個(gè)餾分，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸附率，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，當(dāng)洗脫液用量為1.8BV時(shí)，山楂葉黃酮開始被洗脫下來(lái);洗脫液用量為4BV時(shí)，解吸附率約98.7%，樹脂上吸附的絕大部分的黃酮類物質(zhì)被洗脫下來(lái)。因此，綜合考慮效率、成本等因素，洗脫液的用量為4BV最佳，即洗脫液用量為柱床體積的3倍時(shí)解吸效果是好。

3、解吸附流速對(duì)解吸附效果的影響。稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂，加入樣液吸附至飽和，用無(wú)色蒸餾水洗至無(wú)色，濕法裝柱，用4BV的70%乙醇溶液，分別以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速對(duì)吸附飽和的樹脂洗脫，收集洗脫液，測(cè)定解吸附率，結(jié)果見表6。

從表6中可以看出，解吸附流速為1BV/h與2BV/h時(shí)，二者解吸附率相近，隨著流速的增加，解吸附率減小，表明流速為2BV/h時(shí)，解吸速率高、效果更好。綜合考慮，選擇2BV/h流速作為D101大孔吸附樹脂樹脂的解吸附流速。

（四）大孔吸附樹脂再生性能的確定

以山楂葉黃酮溶液為樣液、上柱流速為2BV/h、樣液pH值為4.0、洗脫液為70%的乙醇溶液、洗脫液用量為4BV、解析液流速為2BV/h為條件，重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定D101大孔吸附樹脂的吸附率和解吸附率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D101大孔吸附樹脂重復(fù)進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，吸附率和解析率均在94%以上，說(shuō)明D101大孔吸附樹脂用于山楂葉黃酮溶液的分離純化有較好的重復(fù)使用性能。

（五）山楂葉黃酮純化效果的測(cè)定

經(jīng)過(guò)D101大孔吸附樹脂處理后，對(duì)山楂葉黃酮處理液進(jìn)行濃縮干燥，樣液中總黃酮得到有效富集純化，總黃酮純度最高可達(dá)94.62%。

三、結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600四種大孔吸附樹脂對(duì)山楂葉黃酮純化效果比較，結(jié)果表明D101大孔吸附樹脂最適合于山楂葉黃酮的純化。

對(duì)山楂葉黃酮純化條件篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，采用上柱流速為2BV/h、樣液pH值為4.0為上柱吸附條件;洗脫液為70%的乙醇溶液，洗脫液用量為4BV，解析液流速為2BV/h為解吸附條件時(shí)吸附效率和解吸附效率均較高。

經(jīng)過(guò)6次重復(fù)對(duì)山楂葉黃酮溶液純化后的D101大孔吸附樹脂所得的黃酮純化物純度仍能保持在94.62%，能用于各種保健品的開發(fā)利用，表明D101型大孔吸附樹脂具備較好的重復(fù)使用性能。

（責(zé)任編輯 曹雯梅）