對蝦養殖高效降解氨氮微生態菌的篩選與鑒定

雷陽 張倩 陳鈺 范玲玉 鄭毅

摘?要：氨氮污染嚴重影響對蝦健康養殖，為了篩選適用于對蝦養殖高效降解氨氮微生態菌，從實驗室前期分離的25株菌株中，通過氨氮降解檢測篩選得到氨氮降解效果較強的4株菌株FS007、FS008、FS017、FS025，其中FS017菌株為最佳氨氮降解菌株，對其培養24 h后進行形態學鑒定：菌落呈白色，表面濕潤，邊緣光滑呈圓形，中間凸起，有黏液;細胞革蘭氏染色呈陽性，桿狀，聚合在一起呈短鏈狀或念珠狀排列，芽孢橢圓形，中生。生理生化試驗：酪素、葡萄糖、明膠、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、淀粉、檸檬酸、硝酸鹽還原、甲基紅試驗、過氧化氫酶、VP反應、需氧性、NaCl（2%～12%）等都表現為陽性，而產氣、果糖、丙酸鹽H2S等表現為陰性。通過16S rDNA分子鑒定，確定該菌為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis。

關鍵詞：對蝦養殖氨氮降解;菌種鑒定;篩選;貝萊斯芽孢桿菌

中圖分類號：S 966.9?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2019）10-003

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.003

Abstract： The pollution of ammonia nitrogen has seriously affected the healthy aquaculture of shrimp. In order to screen the microecological bacteria suitable for the efficient degradation of ammonia nitrogen in shrimp aquaculture， four strains including FS007， FS008， FS017 and FS025 with the strong effect of ammonia nitrogen degradation were obtained from 25 strains isolated from the early stage of the laboratory through the detection of ammonia nitrogen degradation. Among them， FS017 was the best strain with the degradation of ammonia nitrogen. After 24 h of culture， its morphological identification was carried out： The bacterial colony was white， the surface was wetting， the edge was smooth and round， and there was mucilage in the middle， while the cells were positive for gram staining， rod-shaped and arranged in short chain or Beadlike chain together with elliptic and central endospores. And the physiological and biochemical tests were also carried out： the results of casein， glucose， gelatin， xylose， mannitol， arabinose， starch， citric acid， nitrate reduction， methyl red test， catalase， VP reaction， aerobism and NaCl（2%-12%） were all positive， while the results of aerogenesis， fructose and propionate H2S were negative. Therefore， the bacterium was identified as Bacillus velezensis by 16S rDNA molecular identification.

Key words： Degradation of ammonia nitrogen in shrimp aquaculture; Identification of strains; Screening; Bacillus velezensis

近20年來，水產養殖特別是蝦養殖迅速發展，尤其在中國，已成為最重要的漁業生產之一。2018年，蝦類總產量為1161340 t，占甲殼類產量的80.93%[1]。隨著我國對蝦養殖產業的迅速發展，養殖環境水質的惡化以及對蝦疾病頻發已經成為不容忽視的問題，其中養殖水體氨氮過高是影響對蝦養殖產業的一個重要因素。氨氮是對蝦養殖中一種主要污染物，進入組織液內會抑制對蝦生長，降低繁殖能力，甚至引起死亡，嚴重影響了對蝦養殖產業，對蝦養殖池塘中的氨主要是來自于對蝦排泄的結果，是蛋白質代謝的最終產物，也是糞便、未食用飼料和其他有機物中有機氮礦化的結果[2-3]。一般情況下，對蝦可耐受0.4 mg·L-1的氨氮和2 mg·L-1的NO2N[4]，一旦超出范圍，高濃度的氨氮和NO2N，特別是非離子態NH3會直接導致對蝦死亡，大量的排泄物和殘留的餌料會緩慢下沉并積聚在池塘的底部，病原體將繼續生長，池底底泥的缺氧嚴重影響了對蝦的生長環境導致其成活率不斷下降[5- 6]，因此如何控制養殖水體中氨氮的含量，保持水質良好是對蝦養殖面臨重要問題，其中最有效的方法是利用微生態菌的對氨氮分解效應，實現健康養殖。本研究擬分離篩選高效降解氨氮菌株，并進行菌種鑒定，以期制成微生態制劑應用于對蝦養殖。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?試驗菌種?25株芽孢桿菌Bacillussp.，本實驗室前期從對蝦養殖廢水中分離所得，保藏菌種（編號為FS001～FS025）。

1.1.2?菌種培養基配方?蛋白胨10.0 g·L-1、牛肉膏3.0 g·L-1、NaCl 5.0 g·L-1、瓊脂1.5%～2%， pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.1.3?模擬養殖污水配方?葡萄糖0.170 g·L-1、可溶性淀粉0.160 g·L-1、NH4Cl 0.0255 g·L-1、無水乙酸鈉0.233 g·L-1、蛋白胨0.158 g·L-1、牛肉膏0.040 g·L-1、（NH4）2SO4 0.0284 g·L-1、KH2PO4 0.020 g·L-1、無水碳酸鈉0.060 g·L-1。

1.1.4?高鹽度氨氮海水?MgCl2·6H2O 2.1 g·L-1、MgSO4·7H2O 4.2 g·L-1、KCl 0.9 g·L-1、CaCl2·H2O 1.2 g·L-1、NaCl 26.5 g·L-1、NH4Cl0.7638 g·L-1。

1.1.5模擬養殖氨氮污水?取100 mL高鹽度氨氮海水于1000 mL容量瓶中，定容至刻度，倒出置于燒杯中，再按照模擬養殖污水配方依次加入藥品，混勻靜置。

1.2?試驗方法

1.2.1?氨氮檢測?氨氮的測定采用納氏比色法[7-8]。

1.2.2?氨氮降解菌的篩選?將待篩選斜面菌種進行平板活化，從活化的平板上挑取單菌落接種于100 mL種子培養基中，30℃、150 r·min-1振蕩培養24 h。以2%接種量將種子液接入50 mL發酵培養基中，同上培養條件培養12 h，得到菌體發酵液。取1 mL發酵液離心后的菌體接入模擬養殖氨氮污水中，30℃、150 r·min-1培養48 h，取樣檢測污水殘余氨氮含量，從而篩選出具有高效去除氨氮能力的菌株。

1.2.3?菌落形態和細胞形態的觀察?（1）菌落形態：將菌株劃線于LB固體培養基上，30℃培養24 h，觀察菌落特征。（2）細胞形態：在平板上挑取單菌落涂片固定，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察細胞形態。

1.2.4?菌種的生理生化鑒定?待鑒定的菌株按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行糖或醇類利用試驗（葡萄糖、阿拉伯糖、木聚糖）、硝酸鹽還原試驗、H2S產生試驗、

VP試驗、過氧化氫酶試驗、淀粉水解試驗、好氧性試驗、明膠液化試驗、甲基紅試驗（Methyl Red test，MR）、耐鹽試驗和不同溫度下的培養試驗等各項生理生化試驗。

1.2.5?菌種的分子鑒定

1.2.5.1?提取基因組DNA?將分離篩選得到的菌株進行活化與發酵，發酵液鏡檢無雜菌后使用Ezup柱式細菌DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。

1.2.5.2?16S rDNA PCR擴增

（1）原核生物16S rDNA的通用引物。

引物序列如下：

27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′

1429R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′

（2）PCR擴增體系

PCR擴增體系如表1所示。

（3）PCR擴增反應程序

PCR擴增反應程序具體如表2所示。

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用染料4S Red plus浸泡膠體15 min后紫外燈下觀察結果。將體外擴增的16S rDNA基因擴增產物送到北京奧維森生物技術有限公司測序。

（4）16S rDNA進化樹的構建

將得到的序列，在NCBI上進行核酸的同源性比對，選取和待測菌株的序列相似性比較高的多株菌進行序列的比對。用Mega6.06軟件，采用Neighbour-Joining（鄰位相連法）構建系統發育樹，初步確定待測菌株的分類地位。

2?結果與分析

2.1?氨氮降解菌的篩選

取1 mL發酵液離心后菌體接入氨氮為40 mg·L-1模擬養殖氨氮污水中，30℃、150 r·min-1培養48 h，取樣離心后測定上清液中殘余氨氮含量，據此篩選出具有高效去除氨氮能力的菌株。從圖1可以看出，編號為FS007、FS008、FS017、FS025的菌株氨氮的降解效果較理想，其中降解效果最顯著的FS017菌株，氨氮降解率達到76.92%。

2.2?FS017菌種的鑒定

2.2.1?菌落特征?FS017菌株在LB培養基平板上培養24 h觀察菌落形態特征，菌落呈白色，表面濕潤，邊緣光滑呈圓形，中間凸起，有黏液。

2.2.2?細胞形態特征?挑取活化24 h的FS017菌株，進行革蘭氏染色制片，顯微鏡油鏡下觀察。FS017細胞革蘭氏染色呈陽性，桿狀，聚合在一起呈短鏈狀或念珠狀排列，芽孢橢圓形，中生。

2.2.3?生理生化檢測結果?根據《伯杰氏系統細菌手冊》中有關芽孢桿菌的描述對FS017菌株進行各項生理生化試驗。結果如表3，生理生化指標具備芽孢桿菌的典型特征。

2.2.4?菌株16S rDNA的鑒定

2.2.4.1?16S rDNA的擴增?用Ezup柱式細菌DNA抽提試劑盒提取FS017菌株的基因組DNA，并以其基因組DNA作為模板，進行16S rDNA的PCR擴增，用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，PCR擴增電泳結果如圖2所示，FS017菌株PCR的擴增條帶約1500 bp，并將PCR產物進行測序。

2.2.4.2?16S rDNA序列和進化樹的構建分析?菌株FS017的16S rDNA測序結果顯示該序列長度為1402 bp，用Mega6.06軟件對相關菌種16S rDNA進行序列比對并構建進化樹。從圖3可以看出，菌株FS017與Bacillus屬的Bacillus velezensis的親緣關系最近，表明菌株FS017屬于Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿菌）。

3?結論與討論

芽孢桿菌作為水產微生態制劑的菌種廣泛應用于對蝦養殖中，由于可以分泌多種酶，具有降解水中剩余營養物質的作用，達到凈化水質的目的。安健等[9]在對蝦池塘中篩選到一株被命名為YX-6好氧反硝化細菌-凝結芽孢桿菌，并研究了其亞硝酸鹽氮降解性能。趙坤[10]從對蝦養殖環境中篩選4株降解氨氮效果較好的菌株，通過形態特征、生理生化特性以及16Sr DNA序列分析，4株菌都屬于芽孢桿菌屬。高海英[11]從海水池塘底泥樣品分離得到228株芽孢桿菌，經過氨氮降解的篩選，亞硝酸鹽氮等的篩選得到編號為T301和T905兩株菌的降解能力較好，經過鑒定均為枯草芽孢桿菌。徐申波等[12]從凡納濱對蝦養殖水體中的水樣、底泥以及對蝦腸道和糞便樣品中篩選到8株芽孢桿菌。本研究對前期分離的25株芽孢桿菌進行氨氮降解的篩選，獲得4株降解氨氮效果較好的菌株FS007、FS008、FS017、FS025，其中FS017降氨氮能力最強，通過形態學、生理生化試驗及16S rDNA分子鑒定方法確定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis，該菌株文獻鮮有報道，為對蝦養殖提供降氨氮的微生態菌株新資源。

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（責任編輯：柯文輝）