高分辨熔解曲線基因分型技術(shù)及其在水稻分子育種中的應(yīng)用

顧建強(qiáng)

摘?要：高分辨熔解曲線（high-resolution melting， HRM）分型技術(shù)是基于不同DNA片段雙鏈熔解溫度差異而進(jìn)行基因分型的技術(shù)，理論上可以區(qū)分單個(gè)堿基差異的不同DNA分子。由于其較高的分辨率及無需傳統(tǒng)的凝膠電泳等優(yōu)點(diǎn)，HRM技術(shù)發(fā)明后在醫(yī)學(xué)診斷、植物分子育種等方面得到了大量應(yīng)用。通過分析HRM的技術(shù)特點(diǎn)，并總結(jié)HRM技術(shù)在水稻分子育種中的應(yīng)用進(jìn)展，最后展望了HRM技術(shù)在水稻分子育種中的發(fā)展方向及應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：高分辨熔解曲線;基因分型;水稻;分子育種

中圖分類號(hào)：S 511?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2019）10-014

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.014

Abstract： High resolution melting was a genotyping technology based on the double-stranded melting temperature differences of different DNA fragments， which could theoretically distinguish different DNA molecules with single base differences. Because of its advantages such as high resolution and the absence of traditional gel electrophoresis， HRM technology has been widely applied in the aspects of medical diagnosis， plant molecular breeding and so on after its invention. By analyzing the technical characteristics of HRM， the application progress of HRM technology in rice molecular breeding was summarized， and then the development direction and application prospect of HRM technology in rice molecular breeding were prospected.

Key words： High resolution melting; Genotyping; Rice; Molecular breeding

高分辨熔解曲線（high-resolution melting， HRM）是一種新型檢測(cè)突變和基因分型的技術(shù)[1]。由于其檢測(cè)的高效性、高分辨率及較低的成本，HRM技術(shù)自提出后在醫(yī)學(xué)和植物科學(xué)等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。水稻是我國(guó)重要的糧食作物，也是單子葉模式植物，基因編輯和基因聚合育種等分子育種手段在水稻上得到廣泛的應(yīng)用[4]。基于HRM技術(shù)的突變體篩選、全基因組背景標(biāo)記及功能標(biāo)記開發(fā)等工作對(duì)提高水稻分子育種的效率，降低分析成本發(fā)揮著重要作用，具有廣泛的應(yīng)用范圍和前景。

1?HRM基本原理

DNA片段為雙螺旋結(jié)構(gòu)，隨著溫度升高DNA雙鏈會(huì)逐漸解開，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，可以通過監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)觀察DNA雙鏈的熔解程度，根據(jù)溫度和熔解程度繪制熔解曲線。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)一半解鏈的溫度為熔解溫度（Tm），Tm值和DNA分子的堿基組成及長(zhǎng)度相關(guān)，GC含量越高，片段越長(zhǎng)，Tm值越高。因此可以通過分析DNA熔解曲線測(cè)定Tm值對(duì)不同的DNA分子進(jìn)行區(qū)分，實(shí)現(xiàn)基因分型。利用熔解曲線實(shí)現(xiàn)基因分型的關(guān)鍵在于合適的熒光染料及靈敏的檢測(cè)設(shè)備[5]。熒光染料嵌合在DNA雙鏈中，顯示熒光。在熔解曲線的檢測(cè)過程中，隨著溫度逐漸升高，DNA雙鏈逐漸解鏈，熒光染料脫離DNA，成為游離狀態(tài)，使得熒光信號(hào)值逐漸降低。在低溫到高溫過程中，儀器每間隔一定的溫度檢測(cè)1次熒光信號(hào)，最終將采集的熒光信號(hào)繪制為熔解曲線。

熒光染料有飽和染料和非飽和染料兩種類型。最早的熒光染料為SYBR Green I，是一種非飽和染料，在DNA雙鏈高溫解鏈時(shí)，單鏈部分的染料分子發(fā)生遷移，重新結(jié)合到DNA尚未解鏈的雙鏈部分，造成熒光信號(hào)強(qiáng)度沒有發(fā)生變化，不能真實(shí)反映DNA雙鏈準(zhǔn)確的解鏈溫度。而飽和染料則克服了這類問題，DNA解鏈時(shí)脫落的染料不會(huì)再遷移到未解鏈的部分，熒光信號(hào)能真實(shí)反映DNA的解鏈程度。飽和染料有LC Green、LC Green Plus（Idaho）、EvaGreens（Biotum）和LightCycler480 ResoLight Dye （Roche）等多種類型。研究發(fā)現(xiàn)，價(jià)格較低的EvaGreen使用效果和LC Green效果相當(dāng)[6]，因此EvaGreen得到了較廣泛的應(yīng)用[2，7-10]。

由于不同DNA分子間的SNP所導(dǎo)致的Tm值差異細(xì)微，因此要求熒光檢測(cè)設(shè)備控溫準(zhǔn)確、精確以及樣品孔間一致性好。2000年，Idaho公司推出了首款高分辨熔解曲線分析儀HR1。該儀器每攝氏度能采集40～120個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高精度的熔解曲線分析。但該設(shè)備為單通道，無PCR功能，不能滿足高通量檢測(cè)的需求[11]。隨后Idaho公司推出了經(jīng)典的LightScanner。LightScanner有96和384兩種通量可以選擇，并且檢測(cè)速度快，5 min即可完成，實(shí)現(xiàn)了較高通量的檢測(cè)。目前市場(chǎng)上多款定量PCR儀如瑞典Roche公司的lightcycle480[12]、QIAGEN公司的Rotor-gene Q[13]和ABI 7500[14]等均有HRM功能。

2?HRM技術(shù)和其他分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)比較

2.1?高分辨率和高效率

和傳統(tǒng)電泳方式相比，HRM無需制膠、點(diǎn)樣、電泳、讀帶等繁瑣過程，分析效率高，并且傳統(tǒng)電泳包括分辨率較高的聚丙烯酰胺凝膠電泳也難以區(qū)分2個(gè)堿基以下的DNA片段，而HRM可以區(qū)分包括SSR、InDel和SNP在內(nèi)的各種多態(tài)性[15]。

2.2?高穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性

和KASP等基于等位基因競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增方法相比較，擴(kuò)增過程基本沒有假陽性，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、檢測(cè)設(shè)備溫度控制的精確度和均一性。隨著設(shè)備性能的提升，HRM檢測(cè)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性會(huì)更有優(yōu)勢(shì)。

2.3?適用范圍廣

HRM檢測(cè)時(shí)只需要待測(cè)位點(diǎn)兩側(cè)的序列即可，待測(cè)位點(diǎn)可以是未知的，而等位基因競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增則必須已知待測(cè)位點(diǎn)信息，并且只能檢測(cè)雙等位變異。因此HRM技術(shù)有著更廣泛的用途，如復(fù)等位基因檢測(cè)[8]，突變位點(diǎn)檢測(cè)[16-17]等。

3?HRM在水稻分子育種中的應(yīng)用

基于HRM技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，自該方法提出后在水稻分子育種方面也得到了廣泛的應(yīng)用，包括全基因組背景分子標(biāo)記開發(fā)、功能分子標(biāo)記開發(fā)、誘變突變體鑒定、基因編輯后代鑒定等多個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

3.1?全基因組分子標(biāo)記開發(fā)

金名捺等[10]2018年根據(jù)9 k的全基因組芯片對(duì)2個(gè)水稻品種掃描后獲得4198個(gè)SNP位點(diǎn)，將其中第12號(hào)染色體的部分SNP成功轉(zhuǎn)化為HRM標(biāo)記并在群體中進(jìn)行了驗(yàn)證。趙均良等[15]利用HRM技術(shù)對(duì)SSR、InDel和SNP等不同類型的多態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，成功分析了1個(gè)G和A轉(zhuǎn)換的SNP位點(diǎn)，以及1個(gè)聚丙烯酰胺凝膠難以區(qū)分的SSR位點(diǎn)和1個(gè)InDel位點(diǎn)。上述結(jié)果顯示了HRM技術(shù)在DNA多態(tài)檢測(cè)上的靈敏性及靈活性。靈敏性指能分析SNP，靈活性是指能分析包括SNP、SSR及InDel等多種類型的多態(tài)性。

3.2?功能分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

盛夏冰等[12]針對(duì)水稻落粒性基因qSH1調(diào)控區(qū)的關(guān)鍵SNP堿基G到T的突變，通過優(yōu)化擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、DNA及鎂離子濃度等，成功地利用HRM技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因分型，為水稻落粒性的分子育種奠定了基礎(chǔ)。該研究通過比較不同擴(kuò)增大小的產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，小片段（68 bp）更有利于基因分型。羅文龍等[7]采用了巢式擴(kuò)增水稻直鏈淀粉含量Wx基因和香味基因fgr功能位點(diǎn)特異性片段，利用HRM技術(shù)成功對(duì)88份水稻的Wx基因SNP位點(diǎn)及fgr位點(diǎn)的InDel進(jìn)行了分型，顯示了在HRM技術(shù)平臺(tái)的通用性，可以同時(shí)對(duì)SNP和InDel等不同類型的多態(tài)性開展分析。司浩杰等[16]將水稻DNA簡(jiǎn)易提取方法和HRM技術(shù)相結(jié)合，對(duì)花培后代水稻光敏不育基因PGMS進(jìn)行了高效檢測(cè)。平均96個(gè)樣品取樣、DNA提取和檢測(cè)時(shí)間控制在2.5 h。

水稻稻瘟病抗性基因由于存在多個(gè)復(fù)等位基因及在基因組中存在同源序列，導(dǎo)致抗性功能標(biāo)記檢測(cè)繁瑣，金名捺等[8]利用HRM成功地利用HRM技術(shù)開發(fā)了針對(duì)Pi2基因的特異性分子標(biāo)記，并利用該標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)23份水稻不育系均不含Pi2，但能準(zhǔn)確跟蹤4個(gè)Pi2基因改良后代的基因型，顯示了HRM基因檢測(cè)的高效性及準(zhǔn)確性。王平等[9]利用HRM技術(shù)開發(fā)了香味基因fgr，稻瘟病抗性基因Pita及Pik功能標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記分析了46份水稻三系不育系的基因型。Wang等[17]在粳稻品種koshihikari和秈稻guichao2中鑒定了一個(gè)miRNA前體osa-MIR2923a中存在一個(gè)G/A多態(tài)性，利用HRM技術(shù)對(duì)兩個(gè)材料衍生的重組自交系群體進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)種子長(zhǎng)度和該多態(tài)顯著相關(guān)。Shabanimofrad等[2]為篩選抗稻飛虱基因連鎖標(biāo)記，用HRM技術(shù)從110對(duì)SSR標(biāo)記中篩選出57個(gè)多態(tài)標(biāo)記，并篩選到2個(gè)連鎖的SSR標(biāo)記。將水稻抗飛虱基因連鎖的SSR標(biāo)記用HRM技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。

3.3?基因編輯后代等突變體鑒定

TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）技術(shù)是一種定向誘導(dǎo)基因組局部突變的技術(shù)。Li等[18]利用將HRM技術(shù)對(duì)水稻伽馬射線誘發(fā)TILLING突變體庫(kù)后代進(jìn)行了高通量的篩選，發(fā)現(xiàn)以4株M2植株混合一個(gè)池進(jìn)行檢測(cè)效果最佳。在4560個(gè)M2中，對(duì)OsLCT1和SPDT等2個(gè)基因篩選到包括G突變A的SNP、單堿基缺失及3堿基缺失等多種類型的突變。傳統(tǒng)TILLING后代突變體篩選是基于酶切結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式，比較耗費(fèi)時(shí)間和精力。HRM技術(shù)在TILLING上應(yīng)用極大地提高了檢測(cè)效率。類似地，Lochlainn等[19]在白菜的TILLING突變后代中也利用HRM技術(shù)。由于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，在水稻等基因組明確、遺傳轉(zhuǎn)化體系完善的作物上可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，但對(duì)不能遺傳轉(zhuǎn)化，基因組信息未充分闡明的作物上，TILLING技術(shù)仍然是獲得特定基因突變體的重要手段和方式。HRM技術(shù)在TILLING上應(yīng)用極大提高了突變檢測(cè)的效率[20]。

由于HRM技術(shù)的能區(qū)分包括SNP和InDel在內(nèi)的各種類型的多態(tài)性，并且無需已知突變信息的特點(diǎn)，非常適合用于基因編輯后代等突變體鑒定篩選工作。姜明君等[21]利用HRM技術(shù)分析了TALEN定點(diǎn)突變水稻苯達(dá)松抗性基因CYP81A6的后代，從110株T0代轉(zhuǎn)化苗中篩選到3株突變體，和其他基因編輯后代檢測(cè)方式如酶切、測(cè)序等相比較，HRM能以較低的成本完成高效的突變體篩選工作，并且不受突變位點(diǎn)是否存在限制性酶切位點(diǎn)等特征的限制。

4?結(jié)論與展望

HRM技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)便、通量較高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)越來越受到重視，并得到廣泛的應(yīng)用。而水稻是我國(guó)重要的糧食作物，也是植物領(lǐng)域的模式植物。我國(guó)近年來在水稻功能基因發(fā)掘與鑒定方面取得了重要的突破[22-23]，為水稻的分子育種提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于在實(shí)施HRM分析時(shí)需要優(yōu)化擴(kuò)增片段大小、反應(yīng)參數(shù)等以使得擴(kuò)增具有較強(qiáng)的特異性，因此有必要針對(duì)控制水稻重要農(nóng)藝性狀的功能基因開發(fā)基于HRM技術(shù)的分子標(biāo)記，以方便廣大分子育種工作者開展諸如種子資源鑒定、定向改良等工作。另外也有必要開發(fā)一套覆蓋全基因組的背景標(biāo)記，建立基于HRM技術(shù)分子標(biāo)記公共數(shù)據(jù)庫(kù)，加速水稻分子育種工作。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）