慢性不可預見性溫和性應激對大鼠心肌損傷的影響

成文丈 薛慧英 孔繁曄 劉麗娜 于靜 孫夢晗

【摘要】目的：采用慢性溫和性不可預見性應激建立大鼠抑郁模型觀察心肌組織中一氧化氮、一氧化氦合酶、C-反應蛋白含量的變化，探討抑郁對心肌損傷的影響。方法：對SD大鼠成年期施予慢性溫和性應激42天，建立抑郁模型，通過糖水偏好實驗、體重變化記錄行為學指標;應用qRT-PCR方法檢測心肌組織中NOS、CPR mRNA含量，用Elisa方法檢測NO蛋白含量，進一步探討抑郁對心肌損傷的影響。結果：應激組的體重增加量明顯低于對照組（p<0.05）;兩組間大鼠的飲糖水量及糖水偏好指數具有明顯差異（p<0.001）;雄性的體重增加量及糖水消耗量高于雌性（p<0.05）。應激組的5-HTl A的含量低于對照組，應激組的NOS、CRP、NO的含量高于對照組，且具有統計學意義，P值均<0.05。結論：慢性溫和性不可預見性應激誘導NO、NOS、CRP的表達增加心肌損傷的風險。

【關鍵詞】慢性溫和性不可預見性應激，一氧化氦，一氧化氦合酶，C-反應蛋白

[中圖分類號]R541 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）17-0010-02

抑郁癥作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronaryAtheroselerotic Heart Disease，CHD）的獨立危險因素，不但增加CHD的發病率，而且對CHD的預后產生不良影響，嚴重抑郁可使脂質過氧化增加，血漿HNE和ADMA（4甲基-2-NONERAL和不對稱的二甲基精氨酸）水平顯著升高，血漿NO明顯減少，內皮NOS產生減少，從而影響了血管收縮和神經遞質的釋放，影響了血流灌注，加重內皮損傷，最終增加了冠心病風險。但國內研究者通過動物抑郁模型發現心肌中NO、NOS的表達含量的增加，引起心肌的損傷。二者之間的差異性分析需在本實驗研究中進一步的驗證。

1材料與方法

1.1實驗材料成年SD大鼠40只，購置，體質量180～220克，雄性、雌性各20只，飼養條件：（23±2）℃，濕度50%±10%，自然光照（12 h/12 h），自由攝食飲水，雄鼠雌鼠分開飼養。適應環境一周后，隨機分為實驗組和控制組，每組各10只。大鼠、鼠糧、墊料均由遼寧省長生生物技術股份有限公司提供。本實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

1.2實驗方法

1.2.1慢性不可預見性溫和性應激（Chronic unpredictabilityofmild stress，CUMS）

具體的應激方法包括：45°鼠籠傾斜，懸尾3min，濕籠，剝奪飲水或飼料，晝夜光照顛倒等。為避免動物適應應激，干擾應激效果，所有的應激方法均為隨機選定。期間，每周日上午10：00監測小鼠體重變化。4周應激結束后對小鼠進行糖水偏好實驗。造模結束后，先進行行為學測試，測試完成后麻醉大鼠，取各組大鼠心肌和海馬組織，備用。

1.2.2糖水偏好實驗評價大鼠快感缺失狀態實驗前先對大鼠進行糖水預適應，將1%蔗糖水及清水置于大鼠籠上，使其適應糖水味道。實驗前大鼠禁食禁水24h。實驗時將大鼠單獨置于干凈的籠內，籠中放置事先稱質量的糖水瓶及清水瓶各1瓶，0.5 h后交換兩瓶的位置，1 h后取走糖水瓶及清水瓶稱重，計算每只大鼠的糖水偏好情況，糖水偏好值=糖水飲用量/總液體飲用量×100%。

1.2.3用Qrt-pcr法檢測海馬內5-HTlA、心肌內NOS、CRP的mRNA含量先采用Trziol法提取Rna，使用HiScriⅡQSelect RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉錄，后用試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR反應。記錄循環閾值（cycle threshold，ct），通過△△Ct法來計算各個處理組相對于對照組的循環閾值倍數，從而衡量各組間mRNA表達的差異。引物設計如表1。（試劑及引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供）

1.2.4檢測NO蛋白含量采用酶聯免疫吸附試驗法測定NO含量，所有步驟按說明書操作。測試完成后分別根據標準曲線，計算出各組大鼠心肌組織中NO蛋白含量并進行統計分析。（試劑由海聯生物提供）

1.2.5統計方法統計學分析使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計，計量數據均以平均數±標準差（x±s）表示。組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。

2結果

2.1大鼠行為指標變化CUMS結束后的體重與大鼠的最初體重的增加量方面，應激組明顯低于對照組（p<0.05）。CUMS結束后檢測大鼠的飲糖水量及糖水偏好指數具有明顯差異。應激組的糖水消耗量和偏好值明顯低于對照組。雄性的體重增加量及糖水消耗量高于雌性，但糖水偏好值低于雌性。詳見表2和表3。

2.2大鼠的心肌損傷指標及5-HT表達含量的變化應激組的5-HTlA的含量低于對照組，應激組的NOS、CRP、NO的含量高于對照組，且具有統計學意義。見表4。

3討論

慢性不可預見性溫和應激是建立抑郁動物模型較理想的方法之一，能使大鼠出現典型的抑郁癥臨床癥狀，如：興趣喪失、反應遲鈍、情緒低落、記憶力減退、體重減輕等。研究中應激組的體重增加量明顯低于對照組，表明CUMS能誘導大鼠體重減輕。糖水偏好實驗可用于評估模型動物的快感缺失狀態，是衡量陜感缺乏的客觀指標。本研究結果與吳紅芳的研究結果一致，應激組與對照組比較具有明顯差異。研究表明，大鼠成年期遭受CUMS會出現抑郁癥狀，快感缺失。

下丘腦一垂體一腎上腺軸失調導致抑郁的發生。當機體受到應激時，HPA軸調控釋放促腎上腺皮質激素釋放激素，導致5-羥色胺及去甲腎上腺素合成不足，出現與抑郁癥相關的癥狀。抑郁模型的大鼠海馬區的代謝指標亦會出現異常并呈一定規律性動態變化。研究中海馬的5-HT的減少與抑郁癥的發病機制有關。一氧化氮濃度增加，可能通過影響中樞5-HT、NE等神經遞質釋放并加重腦損傷而誘發抑郁癥狀。目前，在心血管方面有學者研究認為持續產生合適濃度的NO有利于心肌的保護。但本研究中心肌組織的NO、NOS含量高于對照組。可能由于NOS在生理狀態下不表達，但可因內毒素和某些細胞因子等激活，通過調控產生大量NO，釋放持續時間長達數小時至數日，超出機體代償范圍而表現出毒性作用，促進細胞凋亡的發生。這提示人體內NO的平衡具有十分重要的作用，一方面，持續產生適合范圍濃度的NO有利于保護心肌;另一方面，失衡會使NO成為心血管的損傷因素，高濃度的NO可能有促凋亡的作用。已有動物實驗證實上調心肌中NOS含量后心肌細胞凋亡增多，而給予NOS抑制劑治療后，心肌細胞凋亡數量減少。

C-反應蛋白與冠心病的發生、發展、危險度分層以及預后密切相關，因此CRP作為冠心病的影響因子之一，被認為是預測未來心血管危險的重要炎癥標記物，CRP還能抑制血管肉皮細胞分泌NO、介導血管平滑肌凋亡。提示慢性炎癥反應可能是抑郁促發、加重冠心病的一個重要的病理生理機制。精神應激或抑郁可能通過改變機體神經內分泌及免疫系統，從而觸發或加重了內皮的損傷以及隨后發生的炎癥過程，進而誘發、促使冠心病的產生。CUMS可以通過刺激炎因子的釋放而形成炎癥，導致冠狀動脈病變。表明炎癥因子可能作為冠心病的一個預測因子，心理應激也能夠增加冠心病的風險。

綜上所述，慢性溫和性應激能夠誘導大鼠心肌損傷，關于心肌損傷的機制仍需進一步研究。但同時表明，心血管疾病患者應在關注原發疾病時亦應關注患者的心理健康，緊靠“雙心”醫學理念，為心血管疾病提供新的治療策略。